miR-153-3p靶向结合BCL2基因调控鼻咽癌细胞增殖、凋亡和周期的实验研究

李 霞,穆建梅,王志婕,闫小会,马瑞霞,陈晓平

鼻咽癌(NPC)是最常见的头颈部肿瘤,在我国南方和东南亚地区尤为常见[1]。通常确诊时已到晚期,其复发和淋巴结转移具有侵袭性,会危及鼻咽癌患者的生命。因此,明确引起鼻咽癌发生、发展、复发及转移相关的分子机制,包括疾病发生和转移的标志物等至关重要。MicroRNAs(MiRNAs)是一类长度在19-24nt的单链非编码RNA,它们是转录后的mRNA负调控因子,通过与靶基因的3′-非翻译区(3′-UTR)结合而发挥作用,导致mRNA降解或翻译抑制[2]。miRNAs调控超过三分之一的人类mRNAs,并且miRNA在某些癌症中的表达失调[3]。miRNA的异常表达可导致靶基因转录调控的改变,并与多种癌症的发生发展过程有关,包括肿瘤的增殖和转移[4]。miR-153-3p已在胃癌、乳腺癌、甲状腺癌、卵巢癌等肿瘤中被深入报道[5-8],但鼻咽癌中miR-153-3p 与BCL2 基因的相互作用及其对鼻咽癌细胞功能的影响尚未见相关研究报道。本课题通过检测miR-153-3p 对鼻咽癌6-10B细胞凋亡、增殖和周期的影响,探讨其可能作用机制,以期为鼻咽癌发生和发展的分子机制提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料:收集2019年10月至2022年2月宁夏医科大学总医院鼻咽癌患者活检癌组织标本30例。

1.1.1 纳入标准:患者无癌症疾病史;采样前无化疗或放疗史。

1.1.2 排除标准:患有其他鼻咽部疾病者;信息不全的患者;不同意被纳入研究的患者。所有被采集的样本均被告知并签署知情同意书,研究方案得到所在医院伦理委员会的批准。

1.2 试剂与仪器:人鼻咽癌细胞系6-10B、CNE1、CNE2、5-8F、C666-1、HNE-1和鼻咽上皮细胞NP69购自ATCC细胞库中国代理商-北纳生物保藏库。miRNA提取试剂盒购自天根(生物)有限公司,总RNA提取TRIzol试剂购自Ambion公司,cDNA逆转录试剂盒和TB Green染料购自TaKaRa公司,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成。miR-153-3p mimic(UUGCAGUCACAAAAGUGAUC)、inhibitor(GAUCACUUUUGUGACUAUGC AA)由上海吉玛基因公司设计合成。CCK-8试剂盒购自吉凯生物有限公司,细胞周期和凋亡(Muse Caspase-3/7)试剂盒均购自密理博公司,荧光素酶活性检测试剂盒购自Promega公司,蛋白抗体一抗和二抗均购自Abcam公司。培养细胞所用血清购自Gibco公司。

1.3 细胞培养和转染:6-10B、CNE1、CNE2、5-8F、C666-1、HNE-1细胞在RPMI 1640 培养基中培养,NP69在Keratinocyte-SFM培养基中培养。培养条件为37℃,5% CO2的培养箱,用青链霉素双抗加10% 胎牛血清培养基进行培养。待细胞生长达90%时,用胰蛋白酶消化后离心(1 000 rpm,5 min),制成单细胞悬液,按照1∶4传代培养。将对数期6-10B细胞接种至6孔细胞培养板,接种浓度为3×105个/孔,待细胞生长至70%进行转染miR-153-3p mimic和inhibitor。转染所用为lipofectamine 3000,转染细胞分析miR-153-3p mimic组、对照组(mimic NC),inhibitor组及对照组(inhibitor NC),转染量为4 μg,培养24～48 h后,收集细胞进行后续试验。

1.4 miR-153-3p及靶基因在鼻咽癌组织和细胞中表达量检测:通过miRNA提取试剂盒和总RNA提取试剂从鼻咽癌、鼻咽癌细胞株及转染miR-153-3p的6-10B细胞中分别提取miRNA和总RNA,之后按照逆转录试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板进行qPCR检测(TB Green染料)。qPCR反应条件:95 ℃预变性1 min;95 ℃变性10 s,59 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共循环40次。以U6或β-actin为内参,采用2-ΔΔCT法分析目标基因的表达情况。ΔΔCT=(实验组CT靶基因-实验组CT U6 或β-actin)-(对照组CT 靶基因-对照组CT U6 或β-actin)。设定2-ΔΔCT>2时表示为表达上调,2-ΔΔCT<-2时表示为表达下调。引物详细信息见表1。

表1 引物信息

1.5 6-10B细胞表型检测

1.5.1 克隆形成能力:收集各转染组鼻咽癌细胞6-10B,并用牛鲍计数板计数,接着将细胞密度稀释到1×103个/mL,然后均匀接种至6孔细胞培养板中,在37 ℃、5% CO2的条件下于培养箱中培养一周后(中间视细胞生长情况进行换液),吸去培养基,然后用PBS洗涤2～3次,用4%多聚甲醛固定30 min后用0.1%结晶紫染色30 min,洗涤后在显微镜下观察、拍照并计数。

1.5.2 细胞增殖能力:将转染后各组细胞计数后制成3×104个/mL的细胞悬液,接种在96孔细胞培养板中(100 μL/孔),分别培养24 h、48 h、72 h 后按照CCK-8试剂盒说明,每孔中加入CCK-8试剂10 μL,继续培养30 min,用酶标仪测定波长在450 nm处的光密度(OD)值,并绘制各组细胞生长曲线。

1.5.3 细胞周期:采用密理博多功能细胞分析仪MUSETM,用细胞周期试剂盒检测各转染组和对照组6-10B 细胞的周期。收集各组6-10B 细胞200 μL(约1×106个/mL),于1.5 mL EP管中离心5 min,PBS清洗1次,加入200 μL提前冷藏的70%乙醇混匀,-20 ℃放置至少3 h,离心5 min PBS清洗1次,添加200 μL 的MUSE细胞周期液,混匀后在室温条件下放置30 min,之后用MUSE多功能细胞分析仪检测细胞周期。

1.5.4 细胞凋亡:采用密理博多功能细胞分析仪MUSETM,用MUSE Casepase3/7细胞凋亡试剂盒检测各组6-10B细胞凋亡情况。收集各组6-10B 细胞200 μL(5×105～1×106个/mL),配制Casepase3/7工作液(1∶8 PBS),准备Casepase7-ADD工作液(2 μL 7-ADD和148 μL BA溶液),将5 μL Casepase3/7工作液加入至50 μL细胞,37 ℃培养5 min,之后加入150μL 工作液7-ADD充分混匀,上机检测细胞凋亡情况。

1.6 检测各分组6-10B中蛋白表达情况:收集各组6-10B细胞置于RIPA 溶液中,在冰上充分溶解,4 ℃离心20 min,取上清液,通过BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取20 μL总蛋白溶于SDS 上样缓冲液,煮沸5 min 后,进行10% SDS-PAGE,将蛋白质转移到PVDF 膜上。5% 脱脂牛奶室温下封闭1 h,PBS 洗膜3次后分别加入各蛋白抗体(均按1∶1 000的比例稀释)4 ℃下过夜孵育。洗膜3 次后加入山羊抗兔二抗(1∶5 000)室温下放置1 h。PBS 洗膜3 次,应用化学发光系统显色并用凝胶成像仪显影,用ImageJ 软件分析蛋白条带的灰度值。

2 结果

2.1 miR-153-3p在鼻咽癌组织和细胞系中表达下调:qPCR法检测结果显示,与癌旁组织相比,miR-153-3p在鼻咽癌组织中表达水平显著下调(P<0.05)。与正常鼻咽上皮细胞NP69相比,在鼻咽癌各细胞系中miR-153-3p的表达显著下调(P<0.05),且在6-10B细胞中下调最明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 上调miR-153-3p抑制鼻咽癌细胞6-10B增殖:转染miR-153-3p mimic 和inhibitor后,qPCR 法检测miR-153-3p表达,与NC 组比较,转染mimic组6-10B细胞中miR-153-3p 表达水平显著上调(FC=6.88,P<0.05);inhibitor组miR-153-3p 表达水平显著下调(FC=0.21,P<0.05)。转染miR-153-3p mimic和inhibitor后检测细胞克隆形成实验,结果mimic组抑制克隆形成,inhibitor促进克隆形成,与对照组NC比较,差异有统计学意义(P<0.05),见图1(封二)。转染miR-153-3p mimic和inhibitor后CCK8检测细胞增殖情况,结果表明,miR-153-3p mimic抑制细胞增殖,inhibitor促进细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.05),见图2(封二)。

2.3 miR-153-3p高表达促进鼻咽癌细胞6-10B凋亡:过表达miR-153-3p(mimic)用密理博的多功能细胞仪(MUSETM)检测6-10B细胞凋亡(caspase3/7)情况,结果显示mimic促进凋亡,而抑制miR-153-3p后,抑制6-10B细胞凋亡,见图3(封二)。之后用蛋白印迹实验检测凋亡相关基因BCL2、Bax、Caspase3和Casepase7,结果显示BCL2在mimic组中表达下调,在inhibitor组中表达上调,而Bax、Caspase3、Casepase7在mimic组中表达上调,在inhibitor组中表达下调,见图4(封二)。

2.4 miR-153-3p对鼻咽癌细胞6-10B周期的影响:转染miR-153-3p mimic和inhibitor后用密理博的多功能细胞仪(MUSETM)做细胞周期实验,mimic组促进细胞由G2期进入M期。inhibitor细胞处于S期比例增多,见图5(封二)。用Western Blotting检测周期相关蛋白CDK1、CDK4和CDK6,CDK1在mimic组中表达下调,在inhibitor组中表达上调。CDK4和CDK6在mimic组中表达上调,在inhibitor组中表达下调,见图6(封二),差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

越来越多的研究显示,miR-153-3p参与了多种肿瘤的发生和发展。如miR-153-3p靶向IDO1调控肺癌细胞免疫抑制相关因子表达[9]。Jiang等[10]的研究显示,在急性淋巴细胞白血病中,miR-153-3p表达水平下调,通过抑制生长蛋白2 的表达而起到抑癌的作用。也有研究显示,miR-153-3p 通过靶向FZD3 调控胃癌SGC7901 细胞的增殖、侵袭与迁移[11]。因此,本研究探讨了miR-153-3p通过靶向调控BCL2影响鼻咽癌细胞增殖、凋亡和周期相关过程。

本研究发现,miR-153-3p在鼻咽癌的组织和细胞系中的表达相比于正常组织和鼻咽上皮细胞均下调,这与其他肿瘤研究结果一致,即miR-153-3p是抑制肿瘤增殖的,如在胃癌、肺癌、乳腺癌、白血病及食管鳞癌等中均有抑制作用[5,6,9-10,12]。miRNA在鼻咽癌的调控作用也有诸多报道,如miR-429及miR-200C相对表达量与鼻咽癌不同临床病理分期有关[13];miR-106A-5p调控影响鼻咽癌恶性表型及调控机制[14]。但是miR-153-3p在鼻咽中的研究鲜有报道,本研究发现,miR-153-3p能够特异性结合BCL2基因,且负向调控该基因的表达,故设计miR-153-3p过表达和抑制实验验证其对BCL2基因的调控作用,从而进一步明确其对鼻咽癌细胞功能的影响。

本研究发现,上调miR-153-3p能够抑制BCL2基因的表达,众所周知BCL2基因在细胞凋亡过程中起负向调控作用[15],如果该基因表达水平受到抑制,细胞凋亡作用可能就会增强。故本研究检测了细胞凋亡情况及凋亡相关的蛋白表达。结果显示,上调miR-153-3p能够促进6-10B细胞凋亡,凋亡相关基因Bax、Caspase3和Casepase7表达呈下降趋势与凋亡细胞结果一致。而BCL2蛋白表达随着miR-153-3p上调受到抑制,说明细胞凋亡受到miR-153-3p结合并负向调控BCL2影响。细胞增殖和迁移实验表明,上调miR-153-3p细胞增殖能力表现出被抑制,反之当miR-153-3p表达受到抑制后细胞增殖能力会增强。以上结果表明,miR-153-3p能够对鼻咽癌细胞的增殖、凋亡和周期水平有明确的调控作用,说明miR-153-3p在鼻咽癌发生、发展和复发过程中具有关键性作用。对其深入研究有望在鼻咽癌的诊断、治疗和预后方面起到一定的积极作用。

本研究显示上调miR-153-3p,促进细胞由G2期进入M期,当miR-153-3p受到抑制后细胞处于S期较多,说明细胞增殖活跃,这与上述细胞凋亡实验结果表现一致,凋亡期细胞增殖活性降低,细胞由G2期进入M期。CDK1也是调控细胞周期的重要分子,miR-153-3p上调,可促进CDK1的表达。miRNA一般通过结合靶基因3′UTR 区并负向调控其表达的方式影响其在机体内的表达水平,从而影响细胞的各种生理过程[16]。研究结果表明,miR-153-3p 能够通过结合BCL2基因3′UTR 区域而抑制BCL2 mRNA 和蛋白的表达,从而影响鼻咽癌细胞凋亡。

综上所述,本研究初步探讨了miR-153-3p在调控鼻咽癌细胞增殖、凋亡和细胞周期过程中的作用,明确了miR-153- 3p通过调控BCL2基因来影响细胞相关功能。本研究为阐明鼻咽癌的发病机制和临床预后提供了参考,为进一步探究鼻咽癌的防治提供了新的思路。