基于电子顺磁共振技术对茶油抗氧化活性的研究

郭浩彬　张陆燕　李敏杰　黄天琪　章银良　赵宇　张丽

摘要：运用电子顺磁共振波谱仪探究不同抗氧化剂对茶油自由基的影响，结果表明，随着温度的升高或反应时间的延长，茶油产生自由基的总量和种类不断增加。通过测量茶油的过氧化值、烷基自由基、烷过氧自由基，可得出TBHQ、BHA、BHT、Vc对茶油均具有保护作用，TBHQ对茶油的保护效果最佳。茶油对不同自由基均具有清除效果，对DPPH自由基的清除率为41.89%，对羟基自由基的清除率为56.31%，对羧基自由基的清除率为26.20%。

关键词：电子顺磁共振波谱技术；茶油；自由基；抗氧化剂

中图分类号：TS255.1文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2023）06-0066-05

Abstract： The effect of different antioxidants on the free radicals of camellia oil is investigated by electron paramagnetic resonance spectrometer. The results show that with the increase of temperature or the extension of reaction time， the total amount and types of free radicals produced by camellia oil increase continuously. By measuring the peroxide value， alkyl radical and alkane peroxy radical of camellia oil， it can be concluded that TBHQ， BHA， BHT and Vc all have protection effects on camellia oil， and TBHQ has the best protection effect. Camellia oil has scavenging effects on different free radicals. The scavenging rates on DPPH free radical， hydroxyl free radical and carboxyl free radical are 41.89%， 56.31% and 26.20% respectively.

Key words： electron paramagnetic resonance spectroscopy technology; camellia oil; free radical; antioxidant

收稿日期：2022-12-20

基金项目：河南省科技攻关项目（182102110094）

作者简介：郭浩彬（1998—），男，硕士，研究方向：食品科学与品质安全。

*通信作者：章银良（1963—），男，教授，博士，研究方向：食品科学与品质安全。

茶籽油亦称山茶油，是从山茶科（Camellia）油茶树的种籽中提炼而得，有“东方橄榄油”之称，被公认为是世界上最好的植物油之一。茶油中含有多种营养成分，如茶多酚、角鲨烯、亚油酸、共轭亚油酸、茶皂素等，对人体具有较高的营养价值[1]。茶多酚的抗氧化性较强，可以预防心血管、癌症等疾病，且具有广谱的抗菌杀毒作用，可有效抑制蜡样芽孢杆菌菌膜形成[2-3]。角鲨烯最初在鲨鱼肝油中发现，后在茶油中也有发现。角鲨烯具有较强的抗氧化能力，可抑制DNA的氧化损伤[4]。亚油酸具有一定的抗氧化性，可有效清除DPPH自由基和ABTS+自由基[5]，共轭亚油酸不仅对肿瘤细胞具有抑制作用[6]，还可提高免疫机能和抗氧化功能[7]。茶皂素可改变细胞膜通透性，破坏细胞膜结构，抑制细菌生长，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌效果[8]。

自由基外层轨道含有不成对电子，有较强的反应活性，环境和内部代谢产生的自由基会对细胞造成损害，攻击细胞内的蛋白质、脂质等物质，导致氧化损伤，进而造成人体功能的损害[9]。而食品中的自由基是食品在发生氧化时形成的，会引起食品变质，降低产品质量并缩短食品的货架期。茶籽油在处理过程中容易发生氧化，其中自由基引发的自动氧化是主要原因之一[10]。抑制自由基的产生对于保证茶籽油的质量及延长茶籽油的货架期具有重要意义。

抗氧化剂是重要的食品添加剂，可抑制食品中脂质和蛋白质等成分的氧化变质，延长食品的货架期，目前在食品加工中已广泛应用[11]。蒋纬等[12]发现茶多酚、BHT、TBHQ 3种抗氧化剂均可有效抑制紫苏籽在储藏过程中的氧化。燕守鑫等[13]发现在花椒籽油中单独添加BHT、TBHQ、PG 3种抗氧化剂以及添加混合抗氧化剂均可有效抑制花椒籽油的氧化变质，POV值显著低于空白组。

电子自旋共振（electron spin resonance，ESR）技术是一种能够快速、简单、直接检测和研究具有未成对电子的化合物的现代分析方法[14]。传统的化学指标和氧化有害产物分析并不能对脂质早期氧化所产生的自由基进行研究，而电子自旋共振技术可对脂质氧化反应早期（未生成初级氧化产物时）产生的含未成对电子的少数自由基进行定性和定量分析[15]。因此，本文利用电子自旋共振技术分析茶油对不同自由基的体外清除效果，以及不同加热条件下不同抗氧化劑对茶油氧化过程中生成的自由基的抑制效果。

1 材料与方法

1.1 材料

茶油：产自湖南省株洲市（未添加抗氧化剂，压榨时间2021年10月，实验时间2022年3月）。

1.2 试剂

石油醚、冰乙酸、氢氧化钠、氯化钠、二甲基亚砜：均为分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；可溶性淀粉、无水乙醇：均为分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；氯甲烷、盐酸：均为分析纯，烟台市双双化工有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基、丁基羟基茴香醚、叔丁基对苯二酚、维生素C、N-叔丁基-α-苯基硝酮、硫代硫酸钠、碘化钾、5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物：均为分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。

1.3 仪器与设备

SQP电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；E-scan Bruker电子顺磁共振波谱仪 美国布鲁克科技（北京）有限公司；FE20 pH计 瑞士梅特勒-托利多公司；HH-1智能型数显恒温油浴槽、HH-S水浴锅 巩义市英峪予华仪器厂；DH-400A电热恒温培养箱 北京中兴伟业仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 茶油抗氧化活性的测定

DPPH·清除能力的测定：参考章银良等[16]的方法，以无水乙醇作为溶剂，配制0.5 mmol/L的DPPH溶液，取100 μL茶油与400 μL DPPH溶液混匀，暗反应20 min后，用毛细管虹吸23.77 μL样品，运用ESR测量DPPH谱图并记录二重积分值为As，空白组用无水乙醇替代茶油，按上述方式测量谱图并记录其二重积分值为Ac。

羧基自由基清除能力的测定：参考Tong等[17]的方法，制备磁性Fe3O4/MoS2 纳米复合材料。取20 mg复合材料、500 μL H2O2（30%）溶于20 mL DMSO中，磁力搅拌后用0.22 μm尼龙膜过滤，于2.5 mL离心管中依次加入20 μL DMPO、800 μL过滤样品液、500 μL茶油并用涡旋仪振荡30 s。用毛细管虹吸23.77 μL样品，5 min后开始测量，将羧基自由基的ESR谱图的二重积分值记录为As，空白组用等量DMSO代替茶油，其余操作一致，其二重积分值记录为Ac。

羟基自由基清除能力的测定：采用芬顿反应[18]，于2.5 mL离心管中依次加入20 μL DMPO、420 μL去离子水、20 μL 5 mmol/L FeSO4、400 μL茶油，随后添加20 μL 50 mmol/L H2O2并用涡旋仪振荡40 s并计时，反应3 min后开始测量，将羟基自由基的ESR谱图的二重积分值记录为As，空白组用等量去离子水代替茶油，其余操作一致，其二重积分值记录为Ac。

自由基清除率（%）=Ac－AsAc×100%。

式中：Ac为空白组的二重积分值，As为对照组的二重积分值，上述3种自由基清除率计算公式一致。

1.4.2 抗氧化剂待测样品的配制

取20 g茶油置于锥形瓶中，按照GB 2760－2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中的规定加入0.02%的BHA、TBHQ、BHT、Vc，超声（时间5 min、功率70 W）溶解后备用。

1.4.3 自由基的测定

1.4.3.1 自由基总量的测定

温度组：在1 mL茶油样品中加入15 mg PBN捕获剂并超声（时间5 min、功率70 W）溶解后，用10 mL的注射器将其注射进核磁管，甩至底部。将其分别置于60，80，100，120，140 ℃的油浴锅中，加热3 min后迅速取出，冷水冲凉并擦拭干净后置于电子自旋共振波谱仪的共振腔中，測定ESR强度（用二重积分表示自由基总量）。

时间组：在1 mL茶油样品及抗氧化剂待测样品中加入15 mg PBN捕获剂，将其置于100 ℃的油浴锅中，每隔2 min迅速取出，其余操作同上，测自由基总量。

仪器测定条件：中心磁场3 487 G；扫描宽度100 G；微波频率9.798 615 GHz；微波功率5 mW；调制幅度1.01 G；调制频率86 kHz；保留时间20.48 s；扫描次数4次。

1.4.3.2 不同自由基种类及含量的测定

向1 mL加入不同抗氧化剂的茶油油样及未加入抗氧化剂的茶油样品中加入50 μL DMPO后超声5 min，溶解后，用10 mL的注射器将其注射进核磁管，甩至底部。将其置于120 ℃的油浴锅中，每隔1 min迅速取出，置于电子自旋共振波谱仪的共振腔中，测定ESR强度（用二重积分表示）。

仪器测定条件：中心磁场3 487 G；扫描宽度100 G；微波频率9.831 712 GHz；微波功率5 mW；调制幅度2.27 G；调制频率100 kHz；保留时间40.96 s；扫描次数4次。

1.4.4 茶油品质指标的测定

采用Schaal烘箱加速氧化试验研究茶油的氧化稳定性，取100 g油样，放入锥形瓶中。将抗氧化剂待测油样和茶油样品置于（60±1） ℃的恒温培养箱内避光保存，每隔1 d 取样1次，测定油样的过氧化值（POV），过氧化值测定参照 GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》中的滴定法。

1.4.5 统计分析

所有试验均做3次平行，采用WinEPR-Processing、Simfonia、Origin 8.0、Mathematics 4.0及其相关方法进行处理，并用SPSS软件进行显著性分析（P<0.05表示差异显著）。

2 结果与分析

2.1 茶油抗氧化活性测定结果

茶油对DPPH自由基、羟基自由基、羧基自由基的清除效果见图1。

茶油中含有大量的茶多酚、维生素E、醌类、类胡萝卜素等具有抗氧化活性的物质，因此茶油本身亦具有较强的抗氧化活性[19-20]。由图1可知，茶油对上述3种自由基均具有较强的清除效果，对DPPH自由基的清除率为41.89%，对羟基自由基的清除率为56.31%，对羧基自由基的清除率为26.20%。DPPH·和OOH·所使用的溶剂能和茶油互溶，因此可以很好地作为衡量茶油抗氧化活性的指标，而芬顿反应是以H2O作为反应溶剂，因此实际操作过程中可采取涡旋振荡后除去上层液或添加乳化剂的形式进行操作。

2.2 不同抗氧化剂对茶油自由基总量的抑制结果

由图2中A可知，随着加热时间的延长，脂肪侧链、含氧官能团等不断发生裂解[21]，导致自由基不断生成，抗氧化剂的加入可以抑制这一过程。不同抗氧化剂对茶油总自由基的抑制作用由强到弱为TBHQ＞BHT＞BHA，而Vc反而使得自由基总量较空白组有所提高，原因可能是茶油在与氧气接触后因高温诱导产生自由基和过氧化物，其中的过氧化物水解或催化会解离生成过氧化氢[22]，而Vc会催化过氧化氢反应，生成大量的羟基自由基[23]。

PBN捕获的油的ESR谱图常用于表示油脂氧化生成的自由基的相对定量研究[24]，由图2中B可知，其谱图的二重积分或利用峰高可表示为氧化前期自由基生成的总量[15]，PBN捕获的油脂自由基由N核和H核环境构成，升高温度和延长反应时间会使茶油氧化更迅速，导致自由基总量不断增加，油的黏性会导致ESR谱图和拟合曲线有所差距（第3个主峰）。

2.3 不同抗氧化剂对茶油不同种类自由基的抑制结果

不同加速氧化的温度会影响产生自由基的种类[25]，由图3可知，在100 ℃加速氧化过程中，DMPO捕获茶油自由基的种类为烷基自由基（R·）、烷过氧自由基（ROO·）、DMPO氧化产生的自由基（DMPO-X），在此加速氧化过程中并未捕获到烷氧自由基（RO·）这可能与加热的条件和仪器的灵敏度相关[26]，在此氧化条件下，茶油中自由基含量最高的为R·，其次为DMPO氧化产生的DMPO-X，而ROO·含量最少。不同抗氧化剂对茶油中不同种类的自由基抑制效果不一致，升高温度会促使ROO·的生成，具体影响结果见图4～图6。

由图4可知，不同种类的抗氧化剂对茶油的烷基自由基均具有抑制作用，抑制效果由强到弱为TBHQ＞BHT＞VC＞BHA，烷基自由基随加热时间的延长呈现出先增后减的趋势，烷基自由基的增长是由于升温促使茶油不断氧化，导致烷基自由基不断积累。而烷基自由基的减少可能存在两种原因：其一，DMPO自身不稳定[15]，随着加热时间的延长，DMPO被氧化，导致补集效果减弱；其二，加热可以加速自由基链式反应[27]，导致烷基自由基转变成烷氧自由基。由图5可知，DMPO自身稳定性较差，在加热条件下会出现开环，形成DMPO-X，导致DMPO捕获效果减弱。由图6可知，不同抗氧化剂对烷过氧自由基的抑制效果显著，其抑制效果主要体现在可以抑制ROO·的强度，以及抑制烷过氧自由基产生的时间，不同抗氧化剂抑制烷过氧自由基的能力由强到弱为TBHQ＞VC＞BHA＞BHT。综上所述，TBHQ对茶油产生的烷基自由基和烷过氧自由基的抑制能力最强，这可能是由于TBHQ能有效削弱茶油自由基的链式反应，但同时加入TBHQ的茶油组产生的DMPO-X自由基信号强度也最强，这一原因有待进一步研究。

2.4 不同抗氧化剂对茶油过氧化值的影响

上述研究中，TBHQ对茶油的烷基自由基和烷过氧自由基的抑制效果最强，但与此同时DMPO-X的信号强度高于空白组，为进一步研究上述抗氧化剂对茶油的抗氧化效果，通过加速氧化，以POV值为指标，進行不同抗氧化剂对茶油过氧化值影响的研究，结果见图7。

由图7可知，该茶油的初始过氧化值＞0.25 g/100 g，高于湖南茶油A级标准（T/HNYC 001－2019），这主要是储存时间过长所致。热处理可以加速油脂氧化，使油脂中过氧化值升高[28]。随着加速氧化过程的进行，茶油氧化程度不断加深，导致过氧化物的含量不断增加，抗氧化剂对茶油中过氧化物具有明显的抑制效果。抑制效果由强到弱为TBHQ＞BHA＞BHT＞VC。综上可知，TBHQ对茶油的抗氧化效果最佳，TBHQ可通过抑制烷基自由基和烷过氧自由基的生成，阻断自由基的链式反应，以减少过氧化物的产生，提高茶油的抗氧化性能。

3 结论

茶油中含有抗氧化活性物质，对DPPH自由基、羧基自由基、羟基自由基均具有清除效果。运用电子顺磁共振波谱技术研究茶油加速氧化过程，结果表明不同抗氧化剂对茶油氧化过程中抑制自由基的程度与抑制过氧化物的生成情况结果接近，因此电子顺磁共振波谱技术可以作为增强茶油氧化前期稳定性的方法。

参考文献：

[1]杨潮，王温娟，唐为玲，等.2种不同方式提取茶油的抑菌活性研究[J].赣南师范大学学报，2021，42（3）：121-124.

[2]高婷，袁芳艳，刘泽文，等.茶多酚的抗菌抗病毒作用[J].动物医学进展，2022，43（4）：107-111.

[3]夏俊芳，王苹，马瑶，等.茶多酚、柠檬醛、肉桂醛对四种接触表面蜡样芽孢杆菌菌膜的影响研究[J].中国调味品，2020，45（12）：27-32，37.

[4]WARLETA F， CAMPOS M， ALLOUCHE Y， et al. Squalene protects against oxidative DNA damage in MCF10A human mammary epithelial cells but not in MCF7 and MDA-MB-231 human breast cancer cells[J].Food and Chemical Toxicology，2010，48（4）：1092-1100.

[5]蒋海艳，庞贵尹，康泰然.山桐子油中亚油酸的纯化工艺及体外抗氧化性研究[J].粮食与油脂，2022，35（2）：59-64，78.

[6]CORL B A， BARBANO D M， BAUMAN D E， et al. cis-9， trans-11 CLA derived endogenously from trans-11 18∶1 reduces cancer risk in rats[J].The Journal of Nutrition，2003，133（9）：2893-2900.

[7]吴国玲.共轭亚油酸和维生素A对蛋鸡免疫机能和抗氧化功能的影响[D].哈尔滨：东北农业大学，2015.

[8]ZHAO Y， SU R， ZHANG W， et al. Antibacterial activity of tea saponin from Camellia oleifera shell by novel extraction method[J].Industrial Crops and Products，2020，153：112604.

[9]王清福，蔡莉莉，刘前进，等.双羟基吡喃酮化合物的合成及清除自由基性能[J].精细化工，2022，39（6）：1205-1211.

[10]王龙祥，罗凡，钟海雁，等.红外与微波处理油茶籽对其原油DPPH自由基清除能力的影响[J].中国油脂，2023，48（1）：37-41.

[11]王莹，邓慧，曾祥辉，等.天然抗氧化剂抑制肉制品氧化研究进展[J].中国调味品，2022，47（2）：216-220.

[12]蒋纬，周鹏，何鸿，等.不同抗氧化剂对紫苏籽贮藏效果的影响[J].中国调味品，2022，47（4）：92-96.

[13]燕守鑫，董崔，王斌，等.温度和不同抗氧化剂对花椒籽油贮藏品质及风味物质的影响[J].中国调味品，2022，47（4）：6-13，20.

[14]刘其耸，石丽花，孙旭媛，等.电子自旋共振技术分析植物油氧化[J].中国油脂，2020，45（11）：109-112.

[15]石硕，于鑫淼，张馨心，等.电子自旋共振技术及其在食品脂质氧化检测中的应用进展[J].食品工业科技，2019，40（5）：343-351.

[16]章银良，黄天琪，张陆燕，等.基于电子顺磁共振波谱法的美拉德反应产物抗氧化活性研究[J].中国调味品，2022，47（5）：55-59，74.

[17]TONG M， LIU F， DONG Q， et al. Magnetic Fe3O4-deposited flower-like MoS2 nanocomposites for the Fenton-like Escherichia coli disinfection and diclofenac degradation[J].Journal of Hazardous Materials，2020，385：121604.

[18]张娟.Fenton铁泥制备硫酸亚铁和聚合硫酸铁及其应用研究[D].南宁：广西大学，2013.

[19]胡孝贵，高学鹏.富硒茶油的研究综述[J].农业与技术，2021，41（4）：24-28.

[20]肖岚，熊敏，幸勇，等.橄榄花椒油抗氧化、抑菌作用及贮藏特性的研究[J].中国调味品，2021，46（4）：61-66，72.

[21]吕波，贺好伟，马明明，等.中低温煤热解过程影响因素研究进展[J].榆林学院学报，2022，32（2）：14-18，24.

[22]張晓媛，陆昭钰，蔡小瑜，等.茶粕提取物对巨峰葡萄的采后保鲜效果研究[J].赣南师范大学学报，2021，42（6）：83-87.

[23]谭诗敏，罗志刚，程建华.H2O2-VC降解对香水莲花多糖结构与活性的影响[J].食品科学，2021，42（24）：48-53.

[24]李培，刘海楠，姜寿浩，等.电子自旋共振波谱法评价花生油氧化稳定性的可行性研究[J].食品工业科技，2015，36（24）：120-123，127.

[25]XIE Y， JIANG S， LI M， et al. Evaluation on the formation of lipid free radicals in the oxidation process of peanut oil[J].LWT-Food Science and Technology，2019，104：24-29.

[26]段虎平，寇宇星，周笙，等.不同外源物对亚麻籽油室温氧化自由基变化的影响[J].食品科学，2021，42（19）：36-42.

[27]孟令璐，李徐，杨铭扬，等.核磁共振氢谱法分析食用油氧化产物[J].中国油脂，2019，44（1）：123-126.

[28]张岩，纪俊敏，侯利霞，等.不同热处理葵花籽方式对葵花籽油品质的影响[J].中国调味品，2022，47（5）：5-14.