青蒿提取物的抗氧化作用及在香肠中的防腐保鲜效果研究

郭育涛　张佳敏　王卫　杨轶浠　侯薄　白婷　刘雅宁

摘要：进行青蒿提取物的主要功能性成分含量分析及提取物体外抗氧化能力评价。在中式香肠中添加不同浓度的青蒿提取物，通过加工、贮藏不同阶段产品特性指标的测定，研究提取物对香肠抗氧化性的影响。结果显示，青蒿提取物的总酚含量为（3.45±0.71） mg GAE/g，总黄酮含量为（9.65±0.41） mg RT/g。通过3种体外抗氧化指标对青蒿提取物的抗氧化活性进行测定，IC50（DPPH）为0.58 mg/mL，IC50（ABTS+）为2.39 mg/mL，FRAP值为0.45 mmol/g。对产品贮藏期菌落总数、酸价、过氧化值、丙二醛的变化进行测定，结果表明，添加青蒿提取物的产品的抗氧化特性得到大大提升，提取物的抑菌作用也极为显著。

關键词：青蒿；提取物；中式香肠；抗氧化性；抑菌作用

中图分类号：TS201.2文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2023）06-0079-08

Abstract： The content of the main functional components of Artemisia annua extract is analyzed and the in vitro antioxidant capacity of the extract is evaluated. Different concentrations of Artemisia annua extract are added into Chinese sausage to study the effect of extract on the antioxidant properties of sausage through the determination of the product characteristic indexes at different stages of processing and storage. The results show that the total phenol content of Artemisia annua extract is （3.45±0.71） mg GAE/g， and the total flavone content is （9.65±0.41） mg RT/g. The antioxidant activity of Artemisia annua extract is determined by three kinds of in vitro antioxidant indexes， IC50 （DPPH） is 0.58 mg/mL， IC50 （ABTS+） is 2.39 mg/mL， and FRAP value is 0.45 mmol/g. The changes of the total number of colonies， acid value， peroxide value and malondialdehyde during the storage period of the product are determined. The results show that the antioxidant properties of the product added with Artemisia annua extract are greatly improved， and the bacteriostasis of the extract is also very significant.

Key words： Artemisia annua; extract; Chinese sausage; antioxidant properties； bacteriostasis

收稿日期：2022-12-25

基金项目：四川省转移支付项目；国家现代农业产业体系四川生猪创新团队（scsztd-2021-08-07）

作者简介：郭育涛（1996－），男，硕士，研究方向：天然产物。

*通信作者：张佳敏（1982－），女，教授，硕士，研究方向：农产品加工与贮藏工程。

青蒿是菊科蒿属一年生草本植物，有清热解毒、解暑止痒、止盗汗等功效，可退阴虚、退潮热[1]，也具有活血、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等功能[2]。青蒿作为药物在我国的历史源远流长，晋代葛洪在《肘后备急方·治寒热诸疟方》中记载：“青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之。” 青蒿的化学成分多样，包括萜类、黄酮类、酚酸类、香豆素以及挥发油等[3]。其中萜类和黄酮类是青蒿的主要成分，具有多种药理功效[4]。近年来，很多研究者通过研究理论与方法分析处理，得到青蒿提取物中很多有效的化学成分[5-7]，并通过药理、药效学研究实验等解释其抗疟、抗炎症、抗氧化、抑菌、身体免疫调节等功能[8-9]，其在药用化妆品[10]、治疗疟疾[11]、畜禽及其饲料[12-13]等商业价值领域发挥着重要作用，而其在肉制品等食品中的抗氧化、抑菌等作用效果很有研究意义，但在此领域的研究却鲜有报道。

香肠制品是深受消费者喜爱的传统腌腊制品，因其脂肪含量较高（约20%～40%），在加工和贮存过程中容易发生氧化而酸败变质[14-15]。同时传统中式香肠的防腐抑菌是保证产品安全的关键，硝盐等防腐剂的过量使用将带来安全隐患[16]，而辐照、高温等均存在对产品品质的不利影响[17-18]。例如经高剂量照射的产品可能会发生不愉快的感官性质变化，高脂肪含量产品辐照后会产生油哈味，灭菌剂量强度太大还会影响其外观色泽；一些化学合成抗氧化剂的热稳定性差且存在一定的毒副作用[5]。随着人们期待肉品中所添加的成分尽可能源自天然产物的消费观念的改变，寻找可替代合成化学添加剂功能的天然提取物显得更有意义和价值[19]。

本研究在分析青蒿提取物成分含量的基础上，进行青蒿提取物体外抗氧化能力的评价，并对添加不同浓度青蒿提取物的中式香肠制品进行贮藏期理化、菌落总数等指标的测定，研究提取物对香肠抗氧化性的影响，为天然植物抗氧化剂的开发、延长肉制品保质期及提升其安全性提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉：成都市十陵镇商超；香肠复合调料：四川国酿食品有限公司；青蒿提取物：长沙中仁生物科技有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒、DPPH自由基清除能力检测试剂盒、ABTS自由基清除能力检测试剂盒、硫代硫酸钠：上海源叶生物科技有限公司；芦丁、亚硝酸钠（NaNO2）、硝酸铝（Al（NO3）3）、氢氧化钠（NaOH）、碳酸钠（Na2CO3）：西安化学试剂厂；没食子酸、Folin- Ciocalteu试剂：北京索莱宝科技有限公司；三氯乙酸、硫代巴比妥酸（TBA）、乙二胺四乙酸二钠、乙醚、异丙醇、酚酞指示剂、氢氧化钠、石油醚、三氯甲烷、冰乙酸、碘化钾、淀粉指示剂、亚硝酸钠：成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

CR-10型色差仪 柯尼卡美能达（中国）投资有限公司；UV-1100型分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；HD-3A型智能水分活度测量仪 无锡市华科仪器仪表有限公司；HHS-11-4型电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；AL-104型精密电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；EPED-EZ-10TJ型超纯水制备仪 南京易普易达科技发展有限公司；BCD-452WDPF型冰箱 青岛海尔股份有限公司；DGG-9030B型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；PHS-3C型pH计 上海三信仪表厂；GHT-DDC型超净工作台 济南杰康净化设备厂；GR60DA型灭菌锅 致徽（厦门）仪器有限公司；LRH-250型生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；H1M型多功能微孔板检测仪 美国Synergy公司。

1.3 实验方法

1.3.1 青蒿提取物的成分含量分析

1.3.1.1 总酚含量测定

参照张玲等[20]、周媛等[21]的方法，并加以改进。精密称取青蒿提取物5.0 g，用70％的乙醇溶解并定容至100 mL为待测液，低温避光保存；准确量取配制的没食子酸标准品溶液 0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.25，2.5 mL，将其依次加入10 mL的干净容量瓶中，加0.5 mL的福林酚试剂，再加入1.5 mL的Na2CO3溶液，涡旋混匀，用蒸馏水定容至容量瓶刻度，并于50 ℃下水浴40 min。在765 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（y）、浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，见图1。得到标准方程y=106.9x+0.038，R2=0.999 4。

总酚含量参考没食子酸（gallic acid，GA）标准曲线，用没食子酸当量（每克干样品中酚类化合物相当于没食子酸的毫克数，mg/g）表示，平行测定3次。

样品总酚含量（mg GA/g）=cvnm。

式中：c为待测样品稀释后的总酚浓度（mg/mL），由标准曲线拟合得出；v为各待测样品提取液总体积（mL）；n为待测样品提取液稀释倍数；m为提取物粉末质量（g）。

1.3.1.2 总黄酮含量测定

参照黄红英等[22]的方法并加以改进。精密称取5.0 g青蒿提取物，用90%的乙醇按照固液比青蒿提取物∶乙醇为1∶40 （g/mL）浸提，于70 ℃下浸提3 h，得到滤液，经蒸馏和浓缩后进行定容；精密称取芦丁对照品5.0 mg，置于20 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解，定容。精密吸取0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8 mL分别置于10 mL干净容量瓶中，加入质量分数为5%的NaNO2 0.15 mL后混匀，静置6 min，加入质量分数为10%的Al（NO3）3 0.15 mL混匀，静置6 min，加入质量分数为4%的NaOH 2 mL，再加水至半刻度，摇匀，静置15 min，以蒸馏水为空白对照，在510 nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标（y）、浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，见图2。得到标准方程y=11.57x+0.012 3，R2=0.999 1。

总黄酮含量参考芦丁（rutin，RT）标准曲线，用芦丁当量（每克样品中黄酮类化合物相当于芦丁的毫克数，mg/g）表示，平行测定3次。

样品中总黄酮含量（mg RT/g）=cvnm。

式中：c為待测样品稀释后的总黄酮浓度（mg/mL），由标准曲线拟合得出；v为各待测样品提取液总体积（mL）；n为待测样品提取液稀释倍数；m为提取物粉末质量（g）。

1.3.1.3 超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）分析

液相色谱条件：色谱柱：Shim-pack Scepter C18-120（50 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相：A相为0.1%甲酸-超纯水，B相为乙腈；洗脱梯度：0～1 min，10% B；1～12 min，10%～100% B；12～14 min，100% B；14～14.1 min，10%～100% B; 14.1～15 min，10% B；流速为0.4 mL/min；柱温为40 ℃；自动进样器温度为4 ℃；进样量时1 μL，样品用乙腈溶解并通过0.22 μm微孔滤膜。

质谱条件：LCMS-9030质谱仪，电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式检测。雾化气体流速3.0 L/min，加热气体流速10.0 L/min，干燥气体流速10.0 L/min，接口温度300 ℃，接口电压分别为4.50 kV（+）和－3.50 kV（－），DL温度250  ℃，加热块温度400  ℃，碰撞能量（30±25） eV。

数据分析：将MS原始数据导入LabSolutions Insight Explore，并采用Formula Predictor分子式预测软件推测可能的分子式。根据一级质谱数据的准确质荷比以及二级质谱数据的碎片信息，结合ChemSpider数据库和相关文献，对化合物进行鉴定。该化合物的质量误差在±5 mg/kg内，保留时间（tR）误差在±0.1 min内；选择负离子加合模式H-以及正离子加合模式H+；主要参数包括：tR范围为0～15 min，最小强度为5%，质量误差为0.10，质量范围（m/z）为100～1 500，碰撞能量的35%用于二级质谱分析，DDA模式分析质量范围（m/z）为50～1 500。

1.3.2 抗氧化活性测试

1.3.2.1 DPPH自由基清除率的测定

参照Solarbio品牌《DPPH自由基清除能力检测试剂盒说明书》。

1.3.2.2 ABTS+自由基清除率的测定

参照Solarbio品牌《ABTS+自由基清除能力检测试剂盒说明书》。

1.3.2.3 羟基自由基清除率的测定

参照源叶品牌《羟自由基清除率检测试剂盒（Fenton微板法）》。

1.3.3 青蒿提取物对中式香肠抗氧化性研究

1.3.3.1 香肠的制作

按照传统中式香肠工艺进行产品制作，将新鲜猪肉用温水清洗后去皮，并剔除筋膜和结缔组织。将肥瘦肉分开并切成小块，添加复合调料，灌入肠衣并每隔10 cm左右旋转打结。将灌制好的香肠用温水漂洗后吸干表面水分，采用10～12 ℃的自然风干法干燥脱水，真空包装后分别在第0，5，10天时测定各项理化指标[23-25]。

将实验香肠分为4组，第1组中以原料肉总质量为基础，不添加青蒿提取物的香肠作为对照组， 第2组中加入0.015%的亚硝酸钠，第3组中加入0.5%的青蒿提取物，第4组中加入2%的青蒿提取物。

1.3.3.2 香肠特性指标测定

按照以下方法进行各项指标测定，每个指标重复测定3次，取平均值。

过氧化值（POV）测定：参照GB 5009.227－2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》中滴定法进行测定。

酸价（AV）测定：参照GB 5009.229－2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》中滴定法进行测定。

丙二醛（TBARS）测定：参照GB 5009.181－2016 《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》。

菌落总数测定：参照GB 4789.2－2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。

2 结果与分析

2.1 青蒿提取物的主要功能性成分含量分析

2.1.1 青蒿提取物的总酚、总黄酮含量

青蒿提取物与其他众多天然植物提取物一样，其主要功能性成分为黄酮和酚，因其抗氧化和抑菌生物活性而被较多关注。Fu等[26] 采用Folin-Ciocalteu （FCM）法、DPPH自由基清除法、ABTS+自由基清除法等几种方法测定麻疯树籽壳酚类物质的含量和体外抗氧化活性，研究结果表明其富含酚类物质和黄酮类物质，表明麻疯树籽壳是一种天然抗氧化剂的新来源，可用于工业化生产;Ahmad[27]用乙醇提取、正己烷提取后乙醇提取、正己烷提取后乙醇盐酸提取和水提取4种不同的提取方法对油棕榈叶提取物中的酚类化合物进行提取，测定了其提取物的总酚含量和总黄酮含量，并将其抗氧化活性与二丁基羟基甲苯（BHT）进行了比较。结果表明，4种不同提取方式的提取物的抗氧化活性与BHT相似，表明油棕榈叶提取物有用作天然抗氧化剂的潜力。

本实验中青蒿提取物总酚含量为（3.45±0.71） mg GAE/g，总黄酮含量为（9.65±0.41） mg RT/g。青蒿提取物中含有与抗氧化和抑菌作用相关的酚类和黄酮类物质，与其他一些抗氧化和抑菌效果较好的天然植物提取物比较，如真空冷冻干燥树莓提取物中的总酚和总黄酮含量分别为（2.47±0.29） mg GAE/g和（2.06±0.61） mg RT/g[28]，枣树的枣叶提取物总酚和总黄酮含量分别为11.82 mg GAE/g和53.5 mg RT/g [29]，代代花提取物总酚和总黄酮含量分别为（10.39±0.40） mg GAE/g和（5.91±0.72） mg RT/g。研究发现多酚和黄酮含量越高，化合物的抗氧化能力越强[30]。青蒿提取物中的总酚和总黄酮含量虽不是最为突出，但仍具备潜在的抗氧化和抑菌活性。

2.1.2 青蒿提取物的化学成分

本实验在正离子模式下利用UPLC-QTOF-MS对青蒿提取物主要化学成分進行分析，结果见表1。从青蒿提取物中鉴定出35种主要成分，其中包括黄酮类32种，多酚类2种，香豆素类1种。在负离子模式下利用UPLC-QTOF-MS对青蒿提取物主要化学成分进行分析，结果见表2。从青蒿提取物中鉴定出37种主要成分，其中包括黄酮类32种，多酚类2种，香豆素类2种，有机酸类1种。由此可知，青蒿提取物富含黄酮类，存在一定的抗氧化性和抑菌性。黄红英等[31]用最佳提取条件对原料青蒿提取物进行提取，得到浅红色浸膏，再通过定性检验分析，结果体现出羟基黄酮和黄酮醇的特性，也验证了青蒿提取物为黄酮类化合物。

2.2 青蒿提取物抗氧化活性评价

2.2.1 DPPH自由基清除率分析

采用DPPH法对青蒿提取物不同浓度下的自由基清除率进行了测定，结果显示各浓度均具有一定的自由基清除作用，见图3。

由图3可知，青蒿提取物浓度为0.13 mg/mL时，DPPH自由基清除率为30.13%；青蒿提取物浓度为0.50 mg/mL时，DPPH自由基清除率达到52.30%；青蒿提取物浓度为1.50 mg/mL时，DPPH自由基清除率达到81.50%。在一定范围内，DPPH自由基清除率与青蒿提取物的浓度呈正相关。其线性关系为y=33.144x+30.764，R2=0.964 5。根据线性回归方程可计算出青蒿提取物对DPPH自由基清除率的半数抑制率IC50为0.58 mg/mL。

2.2.2 ABTS+自由基清除率分析

对不同浓度的青蒿提取物对ABTS+自由基的清除率进行测定，结果见图4。

由图4可知，各浓度提取物均具有一定的自由基清除作用。青蒿提取物浓度在1.00～5.00 mg/mL范围内，ABTS+自由基清除率与青蒿提取物的浓度基本呈线性关系，线性方程为y=7.035 2x+33.218，R2=0.803。其中，青蒿提取物浓度为2.00 mg/mL时，ABTS+自由基清除率为55.83%；青蒿提取物浓度为5.00 mg/mL时，ABTS+自由基清除率达到78.94%；青蒿提取物浓度为10.00 mg/mL时，ABTS+自由基清除率达到95.3%。根据线性回归方程可计算出青蒿提取物对ABTS+自由基清除率的半数抑制率IC50为2.39 mg/mL。

2.2.3 总抗氧化能力分析

采用FRAP法对青蒿提取物不同浓度下的总抗氧化能力进行测定，结果见图5。

随着青蒿提取物浓度的增加，其总抗氧化能力随之增加。青蒿提取物浓度在1.00～5.00 mg/mL范围内时，其FRAP 值与青蒿提取物的浓度呈线性关系，线性方程为y=1.768 7x+0.083 6，R2=0.996 3。另外，将青蒿提取物样品吸光度带入标准曲线，得到青蒿提取物的FRAP值为0.45 mmol/g。

因此，通过对青蒿提取物的3个体外抗氧化指标的测定，对青蒿提取物进行了体外抗氧化能力评价。其体外抗氧化能力IC50值（DPPH）、IC50值（ABTS+）和FRAP值分别为0.58 mg/mL，2.39 mg/mL和0.45 mmol/g，说明青蒿提取物具有较好的体外抗氧化活性，且活性强弱与酚类和黄酮类物质含量呈正相关。

2.3 青蒿提取物对中式香肠的抗氧化、抑菌作用

2.3.1 过氧化值的测定

将不同浓度的青蒿提取物添加于中式香肠中，贮藏期产品过氧化值的测定结果见图6。过氧化值是指每克油脂中过氧化物的毫克当量数[32]。在自由基链式反应的增长阶段，油脂被氧化成过氧化物如 LOO·、LOOH，通过测定过氧化物含量可以判断油脂被氧化的程度，是油脂氧化的初期指标[33]。

由图6可知，4组样品的过氧化值均随着时间的延长而增大，其中空白组的过氧化值增长幅度较大，达到了50%。亚硝酸钠组的过氧化值总体增长幅度较小，增长率为48.8%。青蒿提取物浓度0.5%组和青蒿提取物浓度2%组的过氧化值均在0～5 d增长较快，5～10 d增长较慢，它们的增长率分别为47.5%和48.4%。总体来看，亚硝酸钠组和青蒿提取物浓度2%组的过氧化值增幅较大。从绝对数值来看，青蒿提取物对过氧化值的抑制作用是浓度依赖型，随浓度的增加，其对过氧化值的抑制作用增强。在第10天，添加了2%青蒿提取物的香肠制品的过氧化值基本接近添加了亚硝酸钠的效果。

2.3.2 酸价的测定

酸价是评定油脂水解酸败程度的指标之一，它是中和1 g油脂中的游离脂肪酸所消耗的氢氧化钾的毫克数[33]。添加不同浓度的青蒿提取物的中式香肠在贮藏期的酸价测定结果见图7。

4组样品的酸价都随着时间的延长而逐渐升高，但总体变化幅度不大。其中空白组的酸价相较来说增幅最大，10 d内酸价上升了34.6%。亚硝酸钠组的酸价在10 d内上升较缓慢，增幅仅有9.7%。青蒿提取物浓度0.5%组的酸价在0～5 d上升速度缓慢，但在5～10 d有较大幅度提升，10 d内增长了18.8%。青蒿提取物浓度2%组的酸价上升趋势总体和青蒿提取物浓度0.5%组一致，10 d内增长了22.8%。与空白组相比，3组添加物都在一定程度上抑制了酸价的上升趋势。青蒿提取物组在前5 d基本能同亚硝酸钠组一样控制香肠中酸价的增长；在第5天以后，青蒿提取物组酸价的增长速度略比亚硝酸钠组的高，亚硝酸钠组的抑制效果最好。

2.3.3 TBARS值的测定

丙二醛是油脂酸败的终产物，相对于酸价和过氧化值指标，丙二醛含量更能够反映出油脂实际的氧化程度[34]。添加不同浓度的青蒿提取物的中式香肠在贮藏期的TBARS值变化情况见图8。

由图8可知，10 d内4组样品的TBARS值都随着时间的延长而逐渐增高。其中空白组的TBARS值较高，变化也最明显，10 d内增长了34.2%。亚硝酸钠组、0.5%青蒿提取物组、2%青蒿提取物组在10 d内的TBARS值增长幅度分别为21.4%、27.0%、29.4%。与空白组对比，香肠中不同类别的添加物均有效降低了香肠油脂的丙二醛含量。随着浓度的增加，添加了青蒿提取物的香肠制品的TBARS值增长幅度更低。

2.3.4 菌落总数测定

青蒿提取物对中式香肠贮藏期菌落总数的影响见图9。

由图9可知，4组样品的菌落总数都随着时间的延长而增多。空白组的微生物数量初始值和最终值都最大，分别为5.298，5.537 log CFU/g，其增长率为4.5%。2%青蒿提取物组的菌落总数初始值和最终值都最小，分别为5.273，5.470 log CFU/g，增长率为3.7%。亚硝酸钠组和0.5%青蒿提取物组的菌落总数增长率分别为3.7%、4.6%。结果表明2%青蒿提取物对香肠菌落总数的抑制效果最好，甚至优于添加亚硝酸钠组。

3 结论

本实验对青蒿提取物的成分含量进行分析，结果表明青蒿提取物的总酚含量為（3.45±0.71） mg GAE/g，总黄酮含量为（9.65±0.41） mg RT/g。通过3种体外抗氧化测定对青蒿提取物的抗氧化活性进行验证，IC50（DPPH）为0.58 mg/mL，IC50（ABTS+）为2.39 mg/mL，FRAP值为0.45 mmol/g。结果表明，选用的青蒿提取物含有丰富的黄酮类和多酚类化合物。

進一步将青蒿提取物添加到香肠中，对产品贮藏期指标进行测定，结果显示，提取物可在一定程度上替代亚硝酸钠发挥抑制香肠脂质氧化的作用。在产品贮藏的3个时间段，添加不同浓度青蒿提取物的效果均显著优于空白组，并呈现浓度依赖性，但与亚硝酸钠组相比效果稍弱。而青蒿提取物在香肠产品中的抑菌效果值得关注，其中提取物添加浓度为2%时，效果优于0.5%，但两个浓度所体现的抑菌效果均优于亚硝酸钠组。虽然青蒿提取物组中酸价、过氧化值、丙二醛比对照组略高，其抗脂质氧化的能力仍明显优于空白组，当然在抑菌效果上亚硝酸钠组更优。

由本实验结果可知，青蒿提取物可作为硝盐类化学防腐剂和抗氧化剂的替代物，应用于香肠等肉制品的生产中，在一定程度上发挥抗氧化、抑菌、延长产品货架期的作用。还可通过与其他一些天然植物提取物复配等方式来增强其抑菌、抗氧化和防腐功能，开发出可完全替代硝盐的高效、绿色、天然防腐保鲜剂，对此有待进一步探究。

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