超声波大蒜提取物抑菌性及挥发性成分分析

郭全海　孟君　赵利雪　张峻松

摘要：以乙醇为提取剂，采用超声波辅助提取大蒜，考察了不同条件下（乙醇浓度、超声波提取时间、温度、料液比）大蒜提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用。实验结果表明，不同条件下的大蒜提取物对3种细菌的抑制作用不同。在超声波提取时间25 min、乙醇浓度80%、温度25 ℃、料液比1∶10的条件下，大蒜提取物对大肠杆菌的抑制作用最大；在超声波提取时间10 min、乙醇浓度75%、温度30 ℃、料液比1∶20的条件下，大蒜提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用最大；在超声波提取时间30 min、乙醇浓度75%、温度20 ℃、料液比1∶30的条件下，大蒜提取物对枯草芽孢杆菌的抑制作用最大。采用气相色谱-质谱联用仪，对温度30 ℃、料液比1∶20、乙醇浓度75％、超声波提取时间30 min条件下大蒜浸出物中的挥发性成分进行测定，其成分多达27种以上，主要是酸、酯、酮、烯、硫等化合物，其中硫化物占总化合物成分的9%。该研究为大蒜的有关研究提供了一定参考。

关键词：超声波提取；大蒜；抑菌性；挥发性成分；GC-MS

中图分类号：TS201.3文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2023）06-0036-05

Abstract： With ethanol as the extractant， garlic is extracted by ultrasonic-assisted extraction method. The bacteriostatic effects of garlic extract on Escherichia coli， Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus under different conditions （ethanol concentration， ultrasonic extraction time， temperature and solid-liquid ratio） are investigated. The results show that garlic extract has different bacteriostatic effects on the three kinds of bacteria under different conditions. Under the conditions of ultrasonic extraction time of 25 min， ethanol concentration of 80%， temperature of 25 ℃ and solid-liquid ratio of 1∶10， the garlic extract has the greatest bacteriostatic effect on E. coli; under the conditions of ultrasonic extraction time of 10 min， ethanol concentration of 75%， temperature of 30 ℃ and solid-liquid ratio of 1∶20， the garlic extract has the greatest bacteriostatic effect on S. aureus; under the conditions of ultrasonic extraction time of 30 min， ethanol concentration of 75%， temperature of 20 ℃ and solid-liquid ratio of 1∶30， the garlic extract has the greastest bacteriostatic effect on B. subtilis. The volatile components in garlic extract under the conditions of temperature of 30 ℃， solid-liquid ratio of 1∶20， ethanol concentration of 75% and ultrasonic extraction time of 30 min are determined by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. There are more than 27 kinds of components， mainly are acids， esters， ketones， olefins， sulfurs and other compounds， among which， sulfur compounds account for 9% of the total compounds. This study has provided certain references for the related research of garlic.

Key words： ultrasonic extraction; garlic; bacteriostasis; volatile component; GC-MS

收稿日期：2022-12-23

基金项目：河南省高等学校重點科研项目（22B230009）；河南省高等学校青年骨干教师培养计划（2018GGJS222）

作者简介：郭全海（1980－），男，副教授，硕士，研究方向：分子生物学、免疫学及动物疾病防治。

*通信作者：孟君（1971－），女，教授，硕士，研究方向：食品科学技术与分析。

大蒜（Allium sativum L．）又称作胡蒜、葫、麝香草等，是多年生草本植物，为百合科葱属植物蒜的地下鳞茎部分，味辛，性温，归脾、胃、肺经，是一种调味香辛类蔬菜，也是常见的药用和食用植物[1-3]。大蒜具有多种营养成分和独特的药理保健作用[4] 。大蒜几乎含有所有人体必需的氨基酸、肽类、蛋白质、酶类、糖类、甙类、维生素、微量元素、无机盐及含硫化合物等成分，被称为“地里长出来的抗生素”，具有天然广谱抗菌特性[5]。大蒜中起杀菌、抑菌作用的主要是大蒜素和其他一些有挥发性的硫醚化合物。大蒜素主要存在于大蒜油中，其功能活性取决于大蒜油的制备及特性[6]。提取大蒜素天然产物的方法一般有水蒸气蒸馏法[7]、有机溶剂提取法[8-10]、超临界萃取法[11]、热回流法[12]、超声波辅助提取法[13]。水蒸气蒸馏法：提取设备简易，操作方法简便，但对大蒜素提取产率较低；超临界萃取法：提取的产率非常高，不易破坏原产物，但生产成本、操作技术要求都很高；有机溶剂提取法：提取设备简易，操作方法简便，提取周期短，能耗较低，对大蒜素应用相当广泛。超声波具有强烈空化效应和搅拌作用，可以加速有效成分的浸出速度，不破坏挥发油的主要化学成分，只是提高了挥发油的提取速度[14]。乙醇无毒作为一种优良的提取剂，提取范围广泛。因此，本实验以乙醇作为萃取溶剂，超声波辅助提取，采用抑菌圈方法，研究不同提取条件下超声波大蒜浸出液对3种常见细菌的抑菌效果，通过气相色谱-质谱（GC-MS）联用仪分析大蒜提取液中的化学组成成分，该研究为大蒜抑菌性及天然防腐剂的研究提供了一定参考。

1 材料和仪器

1.1 材料与试剂

大蒜：购于郑州市金水区一家人超市；供试细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），均由本院生物工程实验室提供。无水乙醇（AR）；无水硫酸钠（AR）；营养琼脂粉（生物试剂）。

1.2 主要仪器

TD5A-WS离心机 湘仪离心机仪器有限公司；DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；SW-CJ-IFD净化工作台 苏州安泰空气技术有限公司；LX-C35蒸汽灭菌锅 合肥华泰医疗设备有限公司；SHP-250智能生化培养箱 上海鸿都电子科技有限公司；GC6890-5973MS气相色谱质谱联用仪 美国安捷伦公司；JY1001电子天平 上海浦春计量仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原料的预处理

称取大蒜10 g，用研钵将其研碎，用乙醇将其转移到烧杯中。在一定体积的乙醇溶液中浸泡10 min后，放到超声波清洗器中，设置温度和提取时间，处理后转移到离心管中，以3 000 r/min离心10 min，取上清液到小烧杯中，将灭过菌的无菌滤纸片浸泡10 min，备用。

1.3.2 提取条件的确定

本实验采用超声波提取法提取大蒜中的抑菌成分，提取前将粉碎原料在30 ℃水浴下用乙醇浸泡30 min，软化原料组织内细胞壁，以便超声波发生时更有利于细胞破碎及活性成分溶出。以不同体积分数的乙醇75%、80%、85%、90%、95%，超声波提取时间5，10，15，20，25 min，提取温度20，25，30，35，40 ℃，料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30提取大蒜提取物，研究4个因素在不同条件下大蒜提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制性。通过在各条件下的抑菌实验情况，优化出超声波提取大蒜抑菌活性物质的最佳条件。

1.4 抑菌性实验

1.4.1 培养基的选择与制备

本实验的培养基选用营养琼脂培养基，含有牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、氯化钠等。其中牛肉膏为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而氯化钠提供无机盐。

培养基的制备：称取营养琼脂粉，每1 000 mL培养基需称取琼脂粉45 g，直接放在大烧杯中，加入少于所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后在石棉网上加热使其溶解，待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。用1 mol/L NaOH和 1 mol/L HCl调节pH至7.6，按实验要求，可将配制的培养基分装，灭菌。

1.4.2 菌种的活化

将高压蒸汽灭菌的营养琼脂培养基在无菌培养皿中制成平板，待培养基凝固后，分别用接种环按无菌操作进行平板划线：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌各两组，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h。一组用于实验，另一组放入4 ℃冰箱内储藏备用。

1.4.3 菌悬液的制备

打开超净工作台紫外线灯，照射15 min，关闭紫外线灯，打开白炽灯和风机。分别量取10 mL无菌水于3个试管中，接种环灼烧后分别挑取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌放入无菌水中，充分振荡摇匀，得菌悬液。

1.4.4 抑菌实验[15]

采用滤纸片法，以大蒜的乙醇提取液分别对3种细菌做抑菌实验，将已经灭菌的营养琼脂培养基冷却至50 ℃左右，将其倒入灭过菌的培养皿中，每皿大约15 mL，水平放置，冷却至凝固。每皿加入0.5 mL菌悬液，用三角棒涂抹均匀，将灭过菌的圆滤纸片浸渍提取液2 min。然后用无菌镊子将滤纸片等距放在平板上，每个皿上放3片，每种细菌做3个平行实验。将培养皿倒置，37 ℃恒温培养48 h，取出，测抑菌圈大小，取其平均值作为实验结果。

2 结果与讨论

2.1 大蒜提取物对不同细菌的抑制作用

2.1.1 提取剂浓度对抑菌作用的影响

以乙醇浓度为75%、80%、85%、90%、95%，料液比為1∶20，温度为30 ℃，超声波提取时间10 min，按1.4.4方法提取的提取物分别对3种细菌做抑菌实验。抑菌实验结束后，用直尺测量平板各抑菌圈直径的大小，得大蒜不同浓度的乙醇浸提液对3种细菌的抑菌活性，结果见表1。

由表1可知，超声波作用下不同浓度乙醇的大蒜提取物对3种细菌都有一定的抑菌作用，从抑菌圈直径大小来看，大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌。不同浓度的乙醇提取大蒜，其提取物对同种细菌的作用也有一定差别。从大蒜汁对大肠杆菌的抑菌效果来看，随着乙醇浓度的增大，大蒜浸提液对大肠杆菌的抑制作用呈先增强后减弱的趋势。不同浓度乙醇提取物抑菌作用大小是80%>95%>85%>90%>75%，乙醇浓度为80%时大蒜提取液抑菌圈直径最大；随着乙醇浓度的增大，大蒜汁对金黄色葡萄球菌的抑制作用呈逐渐减小的趋势，85%和80%乙醇大蒜汁对金黄色葡萄球菌的抑菌效果基本无变化，乙醇处理浓度75%>80%（85%）>90%>95%，浓度为75%时乙醇大蒜浸提液抑菌圈最大。

随着乙醇浓度的增大，大蒜汁对枯草芽孢杆菌的抑制作用呈先迅速减小后逐渐增大的趋势，85%、90%、95%的提取物抑菌圈直径变化不大。从大蒜汁对枯草芽孢杆菌的抑菌效果来看，不同浓度乙醇大蒜浸提液的抑菌效果是75%>95%>90%>85%>80%，乙醇浓度为75%时大蒜浸提液抑菌圈最大。

2.1.2 超声波提取时间对抑菌作用的影响

在固定上述最佳提取剂乙醇浓度，即大肠杆菌的乙醇浓度为80%，金黄色葡萄球菌的乙醇浓度为75%，枯草芽孢杆菌的乙醇浓度为75%，料液比为1∶20，超声波提取温度为30 ℃，超声波提取时间为5，10，15，20，25 min进行提取，不同时间下大蒜浸提液的抑菌效果见表2。

由表2可知，在最佳的提取剂乙醇浓度下，随着超声波提取时间的延长，提取液对大肠杆菌的抑制作用呈逐渐增强的趋势。从大蒜汁对大肠杆菌的抑菌效果来看，30 min>20 min>15 min>10 min>5 min，30 min时抑菌圈最大；大蒜汁对金黄色葡萄球菌的抑制作用呈先迅速增强后减弱并趋于平稳的趋势，从不同超声时间下大蒜提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果来看，10 min时抑菌圈最大，抑菌效果较好；随着超声波提取时间的延长，大蒜汁对枯草芽孢杆菌的抑制作用呈先逐渐增强后减弱的趋势。10 min和15 min的抑菌作用基本相同，从大蒜汁对枯草芽孢杆菌的抑菌效果来看，20 min>10 min（15 min）>5 min>30 min，处理时间为20 min的大蒜提取物抑菌圈最大。

2.1.3 超声波提取温度对抑菌作用的影响

在料液比为1∶20，大肠杆菌的乙醇浓度为80%，超声波提取时间为25 min；金黄色葡萄球菌的乙醇浓度为75%，超声波提取时间为10 min；枯草芽孢杆菌的乙醇浓度为75%，超声波提取时间为20 min时分别在超声波提取温度为20，25，30，35，40 ℃下提取，进行提取液抑菌性平板实验，结果见表3。

由表3可知，随着温度的升高，提取的大蒜汁对大肠杆菌的抑制作用增强，之后呈下降趋势。30 ℃和35 ℃时变化不大，40 ℃下提取物的抑菌作用较弱，25 ℃下超声提取液的抑菌作用较好；随着温度升高，大蒜汁对金黄色葡萄球菌的抑制作用也呈先逐渐增强后减弱又平稳的趋势。大蒜浸提液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果：30 ℃>25 ℃>40 ℃>35 ℃>20 ℃，温度为30 ℃时抑菌圈最大；随着温度升高，大蒜汁对枯草芽孢杆菌的抑制作用逐渐减弱。从对金黄色葡萄球菌的抑菌效果来看，20 ℃>25 ℃>30 ℃>35 ℃>40 ℃，温度为20 ℃时抑菌圈最大。

总之，从提取温度对3种细菌的影响来看，在温度较低的情况下，超声波乙醇大蒜提取物的抑菌性較好。

2.1.4 料液比对抑菌作用的影响

在大肠杆菌的乙醇浓度为80%，超声波提取时间为30 min，温度为25 ℃；金黄色葡萄球菌的乙醇浓度为75%，超声波提取时间为10 min，温度为30 ℃；枯草芽孢杆菌的乙醇浓度为75%，超声波提取时间为20 min，温度为20 ℃时；选取料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，得到不同料液比的大蒜提取物对3种细菌的抑制情况，实验结果见表4。

由表4可知，在乙醇浓度80%、超声波提取时间30 min、温度25 ℃、料液比1∶10时大蒜提取液对大肠杆菌的抑制作用最大；在乙醇浓度75%、超声波提取时间10 min、温度30 ℃、料液比1∶20时大蒜提取液对金黄色葡萄球菌的抑制作用最大；在乙醇浓度75%、超声波提取时间20 min、温度20 ℃、料液比1∶30时大蒜提取液对枯草芽孢杆菌的抑制作用最大。

由此可知，在不同的提取条件下，大蒜浸提液表现出不同的活性，从而说明不同提取条件下大蒜提取液中物质成分有一定差别。

2.2 超声波大蒜提取液中挥发性成分的分析

称取大蒜10 g，去皮捣碎，加入75％的乙醇溶液200 mL，放在烧杯中用薄膜覆盖（防止乙醇挥发）。在超声波清洗器中30 ℃超声30 min，冷却后离心（3 000 r/min离心10 min）得上清液。向其中加入少量的无水硫酸钠，于4 ℃冰箱中干燥静置吸附过夜，待测。

2.2.1 上样条件

色谱条件：色谱柱：HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：280 ℃；进样量：1 μL；分流比：5∶1；载气：He，流速1.0 mL/min；升温程序：50 ℃保持2 min，以4 ℃/min 的速率升温至280 ℃，保持20 min。

质谱条件：传输线温度：280 ℃；EI源，电子能量：70 eV；电子倍增器电压：1 635 V；质量扫描范围：30～550 amu；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃。

2.2.2 大蒜挥发性成分分析

对大蒜提取物进行GC-MS分析，经数据库检索，检测大蒜挥发性香气成分主要有50多种，对各色谱峰进行面积积分得到各峰面积百分比，选取比配度大于36的数据，得其主要挥发性成分及含量，见表5。

由表5可知，采用气相色谱-质谱联用仪对超声波提取大蒜液中的成分进行分析，超声波大蒜提取物中主要挥发性成分有27种，主要是酸、酯、酮、烯、硫等化合物。本法提取的大蒜液中含有许多不饱和的硫化物，其中3-苯甲酰亚氨基-5-硫代甲基-1，2，4-二噻唑、二甲基三硫、硫化丙烯、二烯丙基二硫（大蒜辣素）、4-巯基-3-（甲硫基）-（硫内酯）丁烯酸、硫代二乙酸二甲酯等占总化合物成分的9%。大蒜中的抑菌成分非常复杂，可能是多个成分共同作用，包括易挥发和易分解的化合物，也包括稳定和不稳定的化合物，其中易挥发含硫化合物是主要的抑菌活性成分，该分析结果为大蒜抑菌性的进一步研究提供了一定参考依据。

3 结论及分析

本研究以乙醇为提取剂，采用超声波提取大蒜提取液，研究其对3种常见细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌作用，结果表明，该法提取的大蒜液对3种实验菌有较好的抑菌效果，不同条件下大蒜提取物的抑菌作用不同，在乙醇浓度为80%、超声波提取温度为25 ℃、时间为30 min、料液比为1∶10的条件下，大蒜乙醇提取物对大肠杆菌的抑制性最大；在乙醇浓度为75%、超声波提取温度为30 ℃、时间为10 min、料液比为1∶20的条件下，大蒜提取液对金黄色葡萄球菌的抑制性最大；在乙醇浓度为75%、超声波提取温度为20 ℃、时间为20 min、料液比为1∶30的条件下，大蒜提取液对枯草芽孢杆菌的抑制性最大。说明不同条件下大蒜提取物中物质成分不同，从而对3种细菌的抑菌作用不同。实验结果表明，超声波在较低温度、较短时内可使大蒜中抑菌活性成分溶出，超声波处理法对挥发油的提取不破坏主要化学成分，只是提高了挥发油的提取速度。

通过GC-MS测定大蒜超声提取液中成分，结果表明，超声波大蒜乙醇提取物中，大蒜的挥发性成分比较复杂，主要的挥发性化学成分多达50种，比配度大于36的有27种，主要是酸、酯、酮、烯、硫等。其中被分析的大蒜提取液中含硫化合物成分多达6种以上，占总化合物成分的9%。这些含硫挥发性化合物中很多成分均为已知生理活性成分，都具有明显的抗菌、消炎作用，该研究为大蒜抑菌性的相关研究提供了一定参考价值。

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