和厚朴酚对铜绿假单胞菌肺炎小鼠炎症因子及TLR4/MyD88/NF-κB通路的影响

聂佳， 赵家宁， 吴甜甜， 李岩涛

（1.河北中医学院附属医院呼吸重症科，河北石家庄 050013；2.河北省中医院重症医学科，河北石家庄 050013）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是引起医院内感染的主要病原体之一，其分泌的外毒素可抑制蛋白合成，促进组织坏死，是导致肺炎的主要致病菌[1]。PA 诱发的肺炎致死率较高[2]。PA 呈高度多重耐药性，导致临床上治疗PA肺炎存在很大困难[3-4]，因此，迫切需要开发新的药物。大量研究表明，中药具有明确的抗菌作用。PA 肺炎归属于中医学“风温肺热病”范畴，在治疗上以补虚扶正、清热化痰为主。厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia officinalisRehd.etWils.或凹叶厚朴Magnolia officinalisRehd.etWils.var.biloba Rehd.etWils.的干燥干皮、根皮及枝皮，其味苦、辛，性温，具有燥湿消痰、下气除满的作用，为治咳喘痰多所常用。研究发现，厚朴具有PA群体感应抑制活性[5]。和厚朴酚是厚朴的主要活性成分，具有抗菌[6-7]、抗氧化[8]、抗炎[9]等多种药理学活性，既往研究表明，和厚朴酚可减轻脂多糖诱导的急性肺损伤[10]。基于此，本研究通过建立PA肺炎小鼠模型，探讨和厚朴酚对PA肺炎的治疗作用及机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与实验菌株SPF级雄性BALB/c小鼠50只，8周龄，体质量20～25 g，购自北京金牧阳实验动物养殖有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2020-0002。本实验在河北中医学院实验室完成。本动物实验方案经河北中医学院附属医院动物伦理委员会审核批准，伦理审批号：HBZY2022-KY-156-01。根据《全国临床检验操作规程（第2 版）》[11]，按照要求从本院肺炎患者的痰液中分离PA，由检验科细菌室进行鉴定。

1.2 药物、试剂与仪器和厚朴酚（纯度≥98%，分子量266.33，分子式C18H18O2，批号：B20498）购自上海源叶生物科技有限公司。白细胞介素（IL）-6试剂盒（合肥莱尔生物科技有限公司）；IL-1β 试剂盒（上海邦景实业有限公司）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒（上海酶连生物公司）；逆转录试剂盒（上海联迈生物工程有限公司）；Toll 样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）、核因子-κB（NF-κB）引物序列由广州锐博生物科技有限公司合成；兔抗TLR4、MyD88、NF-κB和GAPDH等抗体（美国Abcam 公司）。Cytation 5 型多功能酶标仪（美国BD公司）；Optima L-80XP型超速离心机（美国Bio-Rad 公司）；Bio-Rad iQ5实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 模型制备[12]与药物干预[13]PA 菌液制备：实验前将菌株接种于琼脂培养基上，37 ℃恒温培养箱内培养24 h，观察菌落形态并纯化至单个菌落，接种环挑取单个菌落，无菌生理盐水将菌落调至浓度为1.0×108CFU/mL，再进行100倍稀释，使菌悬液最终浓度为1.0×106CFU/mL。

PA肺炎小鼠模型制备：将50只小鼠按照随机数字表分为正常组、模型组、和厚朴酚低、中、高剂量组，每组10 只。除正常组外，其余各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，固定于手术台上，将小鼠舌头轻轻拉出，调整小鼠头部位置，直至能通过口腔看到声门裂，微量取样器吸取50 μL菌液通过声门裂缓慢滴注于气管内，滴注完成后将小鼠从手术台上取下，使小鼠保持直立位置左右摇摆，以便于菌液均匀分布于小鼠左右两肺。正常组小鼠按照上述方法向气管内注入等体积无菌生理盐水。判断模型成功标准[14]：将小鼠肺组织匀浆后，可培养出铜绿假单胞菌；肺组织病理染色可见大量炎性细胞浸润，纤维增生。

给药[15]：和厚朴酚低、中、高剂量组小鼠于滴注菌液2 h 后分别灌胃浓度为96、192、384 mg/kg的和厚朴酚溶液（溶于生理盐水），正常组和模型组小鼠分别灌胃等体积生理盐水，每日1次，连续4周。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 肺指数测定 于末次给药结束3 h 后，称体质量，腹腔麻醉，打开胸腔，迅速摘取肺组织，生理盐水冲洗干净，滤纸吸取多余水分，称质量，计算肺指数，肺指数=肺脏质量/体质量×100%。

1.4.2 酶联免疫吸附分析（ELISA）检测血清炎症因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平 取小鼠腹主动脉血于采血管中，室温静置30 min，以3 000 r/min离心10 min，离心半径8 cm。吸取上清液为待测样品，严格按照IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA试剂盒说明书进行操作。设置酶标仪波长为490 nm，测定吸光度（OD）值，根据标准曲线计算样品浓度。

1.4.3 HE 染色法观察肺组织病理形态 取小鼠右侧肺上叶组织，4%多聚甲醛固定，经常规脱水、包埋和切片后，二甲苯透明，梯度乙醇脱水，伊红染液染色，双蒸水清洗，苏木素染色，双蒸水清洗，中性树胶封片。显微镜下观察肺组织损伤情况。

1.4.4 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测肺组织TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表达水平取部分肺组织于液氮中研磨，TRIzol 试剂提取总RNA，根据逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录成cDNA，以cDNA 为模板，GAPDH 为内参基因，进行荧光定量PCR 反应。反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共进行40个循环。2-△△CT法计算肺组织TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 相对表达量。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.4.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测肺组织TLR4、MyD88和NF-κB蛋白相对表达量 取100 mg肺组织液氮中研磨，裂解液冰上裂解30 min，于4 ℃以12 000 r/min离心10 min，离心半径8 cm。吸取上清液，以二喹啉甲酸（BCA）试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白浓度，煮沸变性。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，将蛋白湿转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，洗膜，封闭；加入GAPDH、TLR4、MyD88 和NF-κB 抗体（体积比1∶1 000 稀释）4 ℃孵育过夜；洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（体积比1∶5 000 稀释）室温孵育1 h；洗膜，增强化学发光（ECL）法显色，应用ImageJ软件分析条带灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 蛋白条带灰度值。

1.5 统计方法采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）描述，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肺指数比较表2 结果显示：与正常组比较，模型组小鼠肺指数升高（P＜0.05）；与模型组比较，和厚朴酚低、中、高剂量组小鼠肺指数降低（P＜0.05），和厚朴酚高剂量组＜和厚朴酚中剂量组＜和厚朴酚低剂量组。

表2 各组小鼠肺指数比较Table 2 Comparison of lung index in each group of mice（±s）

表2 各组小鼠肺指数比较Table 2 Comparison of lung index in each group of mice（±s）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与和厚朴酚低剂量组比较；④P＜0.05，与和厚朴酚中剂量组比较

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2.2 各组小鼠血清中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平比较表3 结果显示：与正常组比较，模型组IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，和厚朴酚低、中、高剂量组IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平降低（P＜0.05），表现为和厚朴酚高剂量组＜和厚朴酚中剂量组＜和厚朴酚低剂量组。

表3 各组小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平比较Table 3 Comparison of serum levels of IL-6，IL-1β and TNF-α among various groups of mice （±s，pg·mL-1）

表3 各组小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平比较Table 3 Comparison of serum levels of IL-6，IL-1β and TNF-α among various groups of mice （±s，pg·mL-1）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与和厚朴酚低剂量组比较；④P＜0.05，与和厚朴酚中剂量组比较

TNF-α 50.89±7.44 231.85±22.06①174.88±17.36②130.58±15.90②③83.75±11.39②③④组别正常组模型组和厚朴酚低剂量组和厚朴酚中剂量组和厚朴酚高剂量组鼠数/只10 10 10 10 10 IL-6 13.75±4.09 89.62±8.40①71.36±6.58②50.83±6.37②③29.44±5.10②③④IL-1β 39.47±5.09 184.07±11.49①130.56±9.38②105.89±9.61②③73.91±7.47②③④

2.3 各组小鼠肺组织病理形态比较图1 结果显示：正常组小鼠肺组织未见明显异常改变；模型组小鼠肺组织可见严重的炎症细胞浸润、水肿、间质充血，肺泡壁增厚；和厚朴酚低、中、高剂量组小鼠肺组织病理损伤较模型组不同程度减轻。

图1 各组小鼠肺组织病理形态比较（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of histopathological morphology of lung tissue among various groups of mice（HE staining，×200）

2.4 各组小鼠肺组织中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA相对表达量比较表4结果显示：与正常组比较，模型组小鼠肺组织TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 相对表达量升高（P＜0.05）；与模型组比较，和厚朴酚低、中和高剂量组的TLR4、MyD88和NF-κB mRNA 相对表达量降低（P＜0.05），表现为和厚朴酚高剂量组＜和厚朴酚中剂量组＜和厚朴酚低剂量组。

表4 各组小鼠肺组织中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA相对表达量比较Table 4 Comparison of mRNA relative expressions of TLR4，MyD88 and NF-κB in lung tissue of various groups of mice（±s）

表4 各组小鼠肺组织中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA相对表达量比较Table 4 Comparison of mRNA relative expressions of TLR4，MyD88 and NF-κB in lung tissue of various groups of mice（±s）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与和厚朴酚低剂量组比较；④P＜0.05，与和厚朴酚中剂量组比较

NF-κB 4.06±0.73 15.88±2.03①12.47±1.85②8.63±0.95②③6.90±1.04②③④组别正常组模型组和厚朴酚低剂量组和厚朴酚中剂量组和厚朴酚高剂量组鼠数/只10 10 10 10 10 TLR4 2.84±0.55 10.41±1.22①8.39±1.07②6.89±0.94②③4.25±0.71②③④MyD88 2.06±0.36 11.57±1.30①10.41±1.22②8.45±1.32②③4.09±0.84②③④

2.5 各组小鼠肺组织中TLR4、MyD88 和NF-κB蛋白相对表达量比较表5、图2 结果显示：与正常组比较，模型组小鼠肺组织TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）；与模型组比较，表现为和厚朴酚低、中、高剂量组的TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白相对表达量均降低（P＜0.05），表现为和厚朴酚高剂量组＜和厚朴酚中剂量组＜和厚朴酚低剂量组。

图2 各组小鼠肺组织中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白的Western Blot电泳条带Figure 2 Western Blot electrophoresis bands of TLR4，MyD88 and NF-κB proteins in mouse lung tissue in each group

表5 各组小鼠肺组织中TLR4、MyD88和NF-κB 蛋白相对表达量比较Table 5 Comparison of the protein relative expressions of TLR4，MyD88 and NF-κB in lung tissue of various groups of mice（±s）

表5 各组小鼠肺组织中TLR4、MyD88和NF-κB 蛋白相对表达量比较Table 5 Comparison of the protein relative expressions of TLR4，MyD88 and NF-κB in lung tissue of various groups of mice（±s）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与和厚朴酚低剂量组比较；④P＜0.05，与和厚朴酚中剂量组比较

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3 讨论

铜绿假单胞菌（PA）感染引起的肺炎主要是由于缺乏特异性抗菌药物治疗，无法迅速、有效地控制炎症反应，比普通细菌感染更易造成甚至加重机体免疫调节失衡，炎症级联反应更加强烈，导致肺组织损伤更为严重。本研究结果显示：模型组小鼠肺指数显著高于正常组，和厚朴酚低、中、高剂量组小鼠肺指数均低于模型组，且呈剂量依赖性。HE染色结果显示：正常组小鼠肺组织未见明显异常改变；模型组小鼠肺组织可见严重的炎症细胞浸润、水肿、间质充血，肺泡壁增厚；和厚朴酚低、中、高剂量组小鼠肺组织病理损伤得到不同程度的减轻。以上结果说明，和厚朴酚可减轻PA引起的肺炎肺损伤。

研究[16-18]表明：TNF-α 是早期细胞炎症因子，介导中性粒细胞释放，诱导局部炎症反应，同时可刺激其他炎性因子表达；IL-6 是重要的炎症介质，参与整个炎症反应过程，在机体免疫调节中发挥重要作用；IL-1β是典型的促炎细胞因子，成熟的IL-1β 与其受体结合后可激活多种转录因子，触发炎症级联反应。本研究通过ELISA 法检测炎症血清因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平，结果显示，模型组小鼠血清中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平较正常组显著升高，和厚朴酚低、中、高剂量组小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平较模型组降低，表明和厚朴酚可降低PA 引起的肺炎炎症反应。

Toll 样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核因子-κB（NF-κB）信号通路是经典的炎性信号通路，在肺炎的发生与发展中起重要作用[19]。Wang等[20]研究表明，上调miR-143-3p 表达可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路来改善支原体肺炎小鼠肺组织炎症因子水平，减少肺泡上皮细胞凋亡。此外，髓系细胞-1（TREM-1）通过活化TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路可减轻肺通气小鼠肺水肿以及肺组织病理损伤[21]。研究[22]发现，和厚朴酚可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制溃疡性结肠炎小鼠炎症反应，改善结肠组织病理损伤。PA 外膜囊泡可诱导巨噬细胞分泌炎性因子，而沉默TLR4 或使用MyD88（NF-κB）抑制剂后巨噬细胞炎性因子分泌量降低，说明PA 外膜囊泡通过激活TLR4 以及NF-κB 信号通路促进炎症反应[23]。本研究通过qRT-PCR法和Western Blot法分别检测小鼠肺组织中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 和蛋白相对表达量，结果显示：模型组小鼠肺组织中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 和蛋白相对表达量均高于正常组（P＜0.05），和厚朴酚低、中、高剂量组小鼠肺组织中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA和蛋白相对表达量均低于模型组（P＜0.05）。结果表明和厚朴酚可抑制PA引起的肺炎小鼠肺组织中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的异常活化。

综上所述，和厚朴酚可减轻PA 引起的肺炎小鼠肺组织病理损伤，降低炎症反应，减轻肺水肿，其可能是通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路发挥作用。