内异膏对子宫内膜异位症大鼠子宫内膜容受性的影响

谭敏华， 邬素珍， 刘丽丽， 朱巧玲， 陈映， 区绮欣， 张苗苗， 许焕英

（1.佛山复星禅诚医院中医妇科，广东佛山 528000；2.广州中医药大学硕士研究生，广东广州 510405）

子宫内膜异位症（endometriosis，EMS）是腺体、间质等具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆黏膜以外的其他部位而引起的一种妇科常见病，主要临床表现为渐进性加重的痛经、性交痛、腰骶痛等疼痛症状，月经失调，肛门坠胀，盆腔广泛的粘连及不孕。已有研究表明，子宫内膜容受性下降是导致EMS 患者不孕的主要因素[1]。子宫内膜容受性是指子宫内膜最大限度接受胚胎植入时的生理状态，子宫内膜容受性的高低可影响胚胎种植及妊娠结局。本课题组前期临床应用内异膏治疗EMS 及相关不孕症获得良好的临床疗效[2-3]，但其作用机制尚不明确。因此，本研究观察了内异膏对EMS 模型大鼠子宫内膜容受性的影响，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物51只SPF级成熟雌性SD大鼠，体质量180 ～210 g，由珠海百试通生物科技有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（粵）2020-0051。实验单位为广州华腾生物医药科技有限公司，饲养条件：室温24 ℃，12 h 明暗交替，自由摄取无菌营养颗粒饲料与无菌水。该实验方案已通过广州华腾生物医药科技有限公司动物管理和使用委员会审查通过（批号：HTSW211120）。

1.2 药物内异膏，由丹参、血竭、醋莪术、三七、红花、桂枝、桑寄生、盐菟丝子、盐牛膝、川续断、白术、木香、绵茵陈、制佛手、山楂、熟党参、甘草、鸡内金、茯苓、砂仁等中药组成，膏方制作：采用广东省至信药业有限公司生产的中药饮片，按照本院膏方制备工艺流程，统一在本院膏方制作室进行制作。戊酸雌二醇片（规格：1 mg/片，拜耳医药保健有限公司生产，批号：国药准字J20171038）；阿司匹林肠溶片（规格：50 mg/片，陕西白鹿制药股份有限公司生产，批号：国药准字H61023343）。

1.3 试剂与仪器苏木素染液、伊红染液（醇溶）、RNA 提取液、Water Nuclease-Free、Servicebio®RT First Strand cDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR Master Mix（None ROX）（武汉赛维尔生物科技有限公司）；白血病抑制因子（LIF）抗体（美国Abcam 公司）；整合素αVβ3 抗体（美国Bioss 公司）；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）。呼吸麻醉机（北京莱艾特科技发展有限公司产品，型号：iA7）；倒置显微镜（日本Nikon公司生产，型号：Ts2）；正置白光拍照显微镜（日本Nikon公司生产，型号：Eclipse Ci-L）。

1.4 动物分组与造模将51只大鼠按体质量随机分成假手术组与造模组。假手术组为8 只，造模组为43 只。将造模组大鼠构建成EMS 模型，方法：给予0.5 mg/kg 雌激素连续灌胃5 d，第3 天开始连续每天早上进行阴道涂片，观察其是否处于动情期，处于动情期的大鼠当天采用自体移植法行EMS 造模。腹部备皮、消毒、铺巾，沿腹中线在下腹部做一个约3 cm 的切口。选择左侧子宫近端距宫角约1 cm 处用3-0 丝线结扎，远端离卵巢1 cm 处结扎，将缝扎线中间的子宫组织剪下，然后放置在无菌生理盐水中，纵向剪开离体子宫组织，修剪成5×5 mm2大小的子宫内膜片4 片。用5-0 丝线将4 片子宫内膜片分别缝合在腹壁肌肉上，内膜面朝向腹壁。4 片内膜缝合处为距术口大概1 cm 左右两侧，上下相距约1 cm，呈矩形分布。用3-0 丝线逐层缝合腹腔，消毒。术后每只大鼠每日肌注10 万单位青霉素，连续3 d。假手术组大鼠麻醉、备皮方法同上，剖腹后关腹，术后处理同上。术后第3 天开始连续给予0.5 mg/kg雌激素灌胃5 d，常规饲养28 d。术后4 周，随机选取5 只大鼠（假手术组1 只，造模组4 只）进行第2 次剖腹手术，取大鼠正常的在位内膜组织与移植部位的内膜组织，做成石蜡标本，HE染色后进行组织病理学观察，根据造模成功评定标准[4-5]，判断造模成功与否。造模过程中，死亡4只，将剩余造模成功的35 只大鼠随机分为模型组（6 只），内异膏低、中、高剂量组（各8 只），阿司匹林组（5 只）。

1.5 给药确认造模成功后第2 天开始给药。按平均体质量60 kg成年女性的临床剂量，根据《药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算》[6]换算出大鼠生药剂量为1.307 25 g·kg-1·d-1，灌胃低剂量高、中、低剂量比例为4∶2∶1。阿司匹林按成人剂量1.25 mg·kg-1·d-1[7]，折合大鼠用量为7.875 mg·kg-1·d-1灌胃。假手术组与模型组灌胃同体积超纯水。每日1次，连续给药28 d。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 取材 末次给药后次日开始，连续3 d 早上进行阴道涂片观察是否处于动情期，处于动情期的大鼠当天取材。

1.6.2 异位病灶体积、质量测量 异位内膜组织用生理盐水冲洗、滤纸吸水，称病灶质量，测量长宽高，异位病灶体积（V）=0.52×长×宽×高[8]，单位：mm3。

1.6.3 HE染色法观察子宫内膜组织病理形态 取子宫内膜组织常规固定、脱水、包埋、切片，将石蜡切片脱蜡至水，苏木素染细胞核5 min，伊红染细胞质3 min，脱水封片，于光学显微镜下观察。

1.6.4 扫描电镜观察大鼠子宫内膜胞饮突情况 取子宫在位内膜组织，置于2.5%戊二醛中固定，扫描电镜下观察子宫在位内膜胞饮突变化。

1.6.5 采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测大鼠子宫在位内膜HOXA10 mRNA 表达 取子宫在位内膜组织抽提总RNA，反转录后，进行定量PCR 检测。PCR 反应体系：2×qPCR Mix 7.5 μL、2.5 μmol/L 基因引物1.5 μL、反转录产物（cDNA）2.0 μL、Water Nuclease-Free 4.0 μL。采用三步法PCR 扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，设置40个循环。溶解曲线：95 ℃5 s，按照每5 s 上升0.5 ℃的速度从65 ℃升高至95 ℃。结果用2-ΔΔCT法处理。R-HOXA10（1）-S 上游引物序列：5’-AGAAAGGG CTATCTGCTCCCTT-3’；R-HOXA10（1）-A下游引物序列：5’-GCGAGTCGACCAAAAAAGAGTT-3’。

1.6.6 免疫组织化学法检测子宫内膜整合素αvβ3、LIF 表达 取子宫内膜组织石蜡包埋切片，进行脱蜡、抗原修复、血清封闭，一抗、二抗孵育，显色、复染后，应用武汉赛维尔生物科技有限公司开发的Al 病理图像分析系统，自动识别阳性细胞。棕黄色颗粒为阳性细胞，整合素αvβ3 主要表达于子宫内膜腺上皮细胞中，LIF 主要表达于子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞中。随机选取高倍镜下至少3个视野，测定每个视野下的阳性细胞面积，计算阳性面积率。阳性面积率=单位面积中阳性细胞的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%。

1.7 统计方法采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），多组均数间的两两比较采用Bonferroni 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组EMS 大鼠子宫内膜异位病灶大体形态、质量、体积比较连续给药28 d 后，模型组，内异膏低、中、高剂量及阿司匹林组大鼠均未出现死亡，成活率100%。各组EMS大鼠麻醉后行剖腹手术，肉眼观察4个种植的子宫内膜异位病灶，结果如图1所示。模型组异位病灶呈透亮隆起的小包状，内部充满积液，表面有血管增生；内异膏低剂量组的异位病灶大小与模型组无明显差异；内异膏中、高剂量组及阿司匹林组异位病灶较模型组明显缩小，积液明显减少，血管增生明显减少。

图1 各组EMS大鼠子宫内膜异位病灶大体形态Figure 1 Gross morphology of the lesions in each group of EMS rats

表1结果显示：用药后，与模型组比较，内异膏中、高剂量组及阿司匹林组大鼠异位病灶质量、体积明显减小，差异均有统计学意义（P＜0.05），内异膏低剂量组异位病灶质量、体积无明显改变，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组EMS大鼠子宫内膜异位病灶质量、体积比较Table 1 Comparison of lesion mass and volume among various groups of EMS rats（±s）

表1 各组EMS大鼠子宫内膜异位病灶质量、体积比较Table 1 Comparison of lesion mass and volume among various groups of EMS rats（±s）

注：①P＜0.05，与模型组比较；②P＜0.05，与内异膏低剂量组比较

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2.2 各组大鼠子宫内膜组织病理形态比较图2结果显示：假手术组在位子宫内膜结构完整，上皮细胞排列整齐连续，间质细胞、腺体及血管数量正常，腺体周围未见出血及炎性细胞浸润，腺腔完整；模型组子宫内膜异位病灶上皮细胞呈柱状排列增生，间质细胞和腺体数目很多，血管丰富，腺体周围可见出血，可见多量炎性细胞浸润；内异膏低剂量组子宫内膜异位病灶部分上皮细胞呈柱状排列增生，间质细胞和腺体数目较多，血管较丰富；内异膏中剂量组子宫内膜异位病灶未形成完整内膜上皮组织结构，偶见间质细胞，无腺体和血管形成；内异膏高剂量组子宫内膜异位病灶上皮细胞偶见柱状排列增生，腺上皮变薄，间质细胞和腺体数量较少，血管形成较少，腺腔减小；阿司匹林组子宫内膜异位病灶上皮细胞偶见柱状排列增生，腺上皮变薄，间质细胞和腺体数量较少，血管数量较少，腺腔减小。

图2 各组大鼠子宫内膜组织HE染色结果（×200）Figure 2 HE staining Results of endometrial tissue in each group of rats（×200）

2.3 各组大鼠动情期子宫在位内膜胞饮突变化比较图3结果显示：假手术组大鼠子宫在位内膜表面可见较丰富的微绒毛，局部呈团簇样隆起似蘑菇状凸起样结构，大小不一；模型组大鼠子宫在位内膜表面可见微绒毛短小、大小较一致、分布较均匀，没有成熟的胞饮突；内异膏低剂量组大鼠子宫在位内膜表面可见微绒毛短小、分布较稀疏，局部有团簇样隆起似蘑菇状凸起样结构、分布稀疏；内异膏中剂量组大鼠子宫在位内膜表面可见较丰富的微绒毛，局部呈团簇样隆起似蘑菇状凸起样结构；内异膏高剂量组大鼠子宫在位内膜表面可见微绒毛短小，并见少量蘑菇状隆起；阿司匹林组大鼠子宫在位内膜表面覆盖着短小的微绒毛，分布较为分散，有中量蘑菇状隆起，大小不一。由此可见，假手术组胞饮突表达多处于成熟期，模型组胞饮突处于发育期，内异膏各剂量组胞饮突发育较模型组有所改善，成熟的胞饮突有所增多，阿司匹林组成熟胞饮突增多更明显。

图3 各组大鼠动情期子宫内膜胞饮突变化比较（扫描电镜）Figure 3 Comparison of changes in the endometrial pinopodes during the motility phase in each group of rats（scanning electron microscopy）

2.4 各组大鼠子宫在位内膜组织同源框基因（HOXA10）mRNA 表达水平比较 表2 结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠子宫在位内膜组织HOXA10 mRNA 表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，内异膏中剂量组大鼠子宫在位内膜组织HOXA10 mRNA 表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），而其余治疗组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠子宫在位内膜组织HOXA10 mRNA相对表达量比较Table 2 Comparison of mRNA relative expression level of HOXA10 in endometrial tissue in each group of rats（±s）

表2 各组大鼠子宫在位内膜组织HOXA10 mRNA相对表达量比较Table 2 Comparison of mRNA relative expression level of HOXA10 in endometrial tissue in each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，与模型组比较

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2.5 各组大鼠子宫内膜组织整合素αvβ3、白血病抑制因子（LIF）表达比较表3、图4、图5 显示：与假手术组比较，模型组子宫内膜组织整合素αvβ 3、LIF 阳性面积率均有所下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，各治疗组的整合素αvβ3、LIF 阳性面积率差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠子宫内膜组织整合素αvβ3、LIF阳性面积率比较Table 3 Comparison of integrin αvβ3 and LIF positive area ratio of endometrial tissue in each group of rats（±s，%）

表3 各组大鼠子宫内膜组织整合素αvβ3、LIF阳性面积率比较Table 3 Comparison of integrin αvβ3 and LIF positive area ratio of endometrial tissue in each group of rats（±s，%）

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图4 各组大鼠子宫内膜组织整合素αvβ3免疫组织化学结果（×200）Figure 4 Immunohistochemical Results of integrin αvβ3 in endometrial tissue in each group of rats（×200）

图5 各组大鼠子宫内膜组织白血病抑制因子（LIF）免疫组织化学结果（×200）Figure 5 Immunohistochemical Results of LIF in endometrial tissue in each group of rats（×200）

3 讨论

子宫内膜异位症（EMS）是妇科常见的疑难病，其发病机制尚未完全明确。研究[9]表明，女性不孕40%～50%是EMS 引发的。中医治疗EMS 有明显的优势，2019 年《子宫内膜异位症中西医结合诊治指南》[10]提出中西医结合治疗EMS，可提高临床疗效。EMS 归属于中医学“痛经”“癥瘕”“月经失调”“不孕”等范畴。中医学对EMS发病机制具有独特的认识，认为血瘀是贯穿EMS 发生、发展的中心环节，也是EMS 最基本的病理基础。临床中，肾虚血瘀型是EMS 最常见的中医分型。内异膏是广东省首批百名优秀中医临床人才、广东省首批名中医师承项目指导教师邬素珍教授在“陈氏内异丸”的基础上，结合自己多年的临床经验和临床研究结果不断优化得出的治疗肾虚血瘀型EMS 的有效组方。方中：丹参、血竭活血化瘀止痛为君药；莪术、三七、红花活血化瘀调经共为臣药；桂枝温经通脉，佛手理气止痛，桑寄生、菟丝子、川续断、盐牛膝补益肾气，党参、白术、茯苓、甘草、木香、砂仁、绵茵陈、鸡内金、山楂等健脾益气和胃，共为佐药。诸药合用，共奏活血化瘀、软坚散结、理气止痛、补肾固本之功效[2]。

本研究比较了各组大鼠子宫内膜异位病灶体积、质量的变化情况，结果显示，与模型组比较，内异膏中、高剂量组及阿司匹林组大鼠异位内膜病灶质量、体积明显减小（P＜0.05）。从病理组织学来看，与模型组比较，内异膏各剂量组及阿司匹林组大鼠的异位内膜组织均有不同程度的萎缩。表明内异膏可以抑制异位内膜的增生，使异位病灶缩小。

胞饮突是目前公认的子宫内膜容受性的形态学标记[11]，成熟的胞饮突标志着子宫内膜容受性的建立[12]。Nikas 等研究[13]显示，胞饮突存在3 种状态：①发育：细胞膨胀，微绒毛减少端融合形成一个光滑细长的膜状突起；②成熟：微绒毛消失，突起最大且折叠成类似花朵或者蘑菇状；③退化：微绒毛重现，体积减小，有褶皱。胞饮突的发育过程在所有的哺乳动物中都是相同的。本研究结果显示，假手术组胞饮突表达多处于成熟期，模型组胞饮突处于发育期，内异膏各剂量组胞饮突发育较模型组有所改善，成熟的胞饮突有所增多，阿司匹林组胞饮突改善情况较内异膏组更明显。表明内异膏可以改善EMS 大鼠的胞饮突发育，使成熟期胞饮突数量增多，使子宫内膜容受性升高。

LIF 的表达与胞饮突的形成呈正相关[14]，并可促进子宫内膜蜕膜化完成[15]，被视为重要的子宫内膜容受性标志物之一。整合素是一种依赖Ca2+介导细胞进行内外环境联系的跨膜受体，属于黏合家族的一组细胞黏附分子。整合素avβ3 的表达与“种植窗”的开启时间相一致，且主要表达于子宫内膜的上皮细胞和血管中，可以作为一种子宫内膜容受性和“种植窗”开放的标志[16-17]。在基因方面，HOXA10 是子宫内膜容受性的重要调节因子[18-19]。子宫内膜细胞HOXA10表达缺陷时，可引起子宫内膜容受性下降，造成胚胎植入失败[20]。周伟等[21]研究发现，HOXA10基因在EMS大鼠子宫内膜中的表达显著降低。李丽娜[22]观察到HOXA10水平在正常人血清中较EMS 导致不孕患者血清中含量高。萨日娜等[23]发现，子宫腺肌病患者无论在增殖期还是分泌期，在位子宫内膜HOXA10 及整合素β3（Intβ3）的表达均下降。胡泉等[24]发现，EMS患者子宫内膜组织中LIF 低表达。潘一红等[25]发现，EMS 患者种植窗期的子宫内膜、取卵日卵泡液中LIF表达均下降。但李玉芳团队[26]却发现，异位内膜组织整合素αvβ3 阳性表达率为80%，在位内膜为62.5%，正常内膜为16.67%。

本实验的数据经过反复检测、核对与验证，发现：在动情期的EMS 模型组大鼠在位内膜HOXA10 基因表达及整合素αvβ3 和LIF 的表达与假手术组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，内异膏中剂量组大鼠在位内膜HOXA10 mRNA 低于模型组（P＜0.05），而其余治疗组大鼠在位内膜的HOXA10 mRNA 表达无统计学差异（P＞0.05）；与模型组比较，各治疗组的整合素αvβ3 及LIF 的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。表明内异膏对EMS 大鼠在位内膜HOXA10基因表达及整合素αvβ3 和LIF 的表达无明显改善作用。

综上所述：①内异膏对EMS 大鼠治疗效果明显，可减小异位病灶体积、质量，改善异位内膜组织结构病理改变，但治疗效果是否与剂量相关，在临床使用中如何选择最佳剂量，有待进一步研究；②内异膏可以改善EMS 大鼠的胞饮突，使成熟期胞饮突数量增多，使子宫内膜容受性升高；③HOXA10 基因及整合素αvβ3 和LIF 在EMS的判断及治疗中可能无明显实际意义，下一步有待扩大样本量，得出更有代表性的结论。