女子柔道运动员尿液代谢组学代谢物特点研究

赵丽霞，刘月涛，朱彦蓉，邵 彤

机体代谢组学从整体角度对生物体系统进行综合研究，以反映个体的生命状况。代谢组学在竞技体育中作为运动人体科学研究的新工具，在研究运动性疲劳和运动训练的生理生化方面具有很大优势（黄彩华 等，2011）。运动对机体代谢组学的影响是近几年研究的主要内容。运动人体科学工作者从机体尿液代谢组学以及血清代谢组学的角度，探究不同运动项目、运动状态、运动营养补充后机体的反应情况。运动量表从心理测量角度反映运动员的运动训练状态。通过运动训练状况监测量表所建立的过度训练模型，可以反映出运动负荷对运动员的影响，以进一步评价运动负荷。

基于此，本研究运用代谢组学方法对运动员尿液代谢组学特征进行分析，以了解女子柔道运动员机体物质代谢特征，由此反映出运动员的机能状态和运动员的代谢状况。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

以山西女子柔道队18 名女子柔道运动员为研究对象，对运动员日常训练期间晨尿的代谢组学代谢物进行研究。将运动员按照1～18 编号。同时向运动员发放《运动员训练状态监测量表》（晏宁，2003），以反映运动员训练期间的心理状态和疲劳状态。

1.2 研究方法

1.2.1 仪器与材料

仪器：Bruker 600-MHz Avance Ⅲ NMR Spectrometer（600.13 MHz 质子频率，德国布鲁克公司600 兆核磁仪），TGL 高速台式冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司），SC-3610 低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），XK80-A 快速混匀器（江苏新康医疗器械有限公司）。

材料：重水D2O（Norell，Landisville，USA），磷酸缓冲溶液（磷酸氢二钾K2HPO4和磷酸二氢钠NaH2PO4，pH=7.4，含TSP 0.01%），三甲基硅烷丙酸钠盐（TSP，Cambridge Isotope Laboratories Inc.，MA），氢氧化钠（NaOH）等。

1.2.2 实验方法

留取18 名女子柔道运动员的晨尿并存放在尿液采集试管中，收集试管并编号后以冰袋冷藏，之后立即转运至测量中心。将尿液样品以3 000 r/min 离心10 min，取上清液，储存于-80 ℃保存（每份不少于1 mL）。

将尿液样品缓慢解冻，使用移液枪精密吸取500 μL 加入EP 管中，加入200 μL 磷酸缓冲溶液，涡旋30 s，于4 ℃、13 000 r/min 离心20 min，取上清液600 μL 移至5 mm 核磁管中待测。采用noesyppr1d 脉冲序列，以压制残余水信号，内标为TSP。样品在25 ℃下使用Bruker 600-MHz AvanceⅢ NMR Spectrometer 进行核磁图谱分析，测定频率为600.13 MHz，扫描次数为64，谱宽为12 345.679 Hz，脉冲时间为14.0 μs，采样时间为2.654 s，延迟时间为1.000 s，采样间隔为40.5 μs。

尿液核磁图谱采用MestReNova 6.1.0 进行处理，对所有1H 核磁共振波谱（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）图谱进行手动相位和基线调整。所有图谱以TSP（δ 0.00）为标准，对谱图进行化学位移的校正，调整相位、基线，以δ 0.01 对化学位移区间进行分段积分，其中δ 4.60～5.20（残余水峰）不进行积分，剩余的信号积分值进行归一化并将积分数据导入Excel 表格中，以待作进一步的统计分析。

1.2.3 数据处理

运用SIMCA-P 13.0（Umetrics，瑞典）软件将积分数据进行多元统计分析。首先采用主成分分析（principal component analysis，PCA）方法对样本内部固有的差异性和相似性进行分析，然后采用偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），以获得更好的样本分类效果。

将进行1H NMR 尿液代谢组学测取的代谢物峰面积数据导入SPSS 21.0 统计软件中，运用方差分析方法进行统计分析。

1.2.4 运动训练心理状态的监测

实验以晏宁（2003）为监测运动员过度训练而研制的心理量表为依据，其设计的《运动员训练状态监测量表》包括45 个题目、7 个选项，包含8 个分量表，分别为情绪应激、感觉良好、疲劳、自我效能、自我调节、体能恢复、心理耗竭、心理疲劳（张力为 等，2010）。将该量表发放给运动员进行测量。分量表条目相加后的得分即为分量表得分。将该得分导入SPSS 21.0 统计软件，采用方差分析方法即可对数据进行统计分析。

2 研究结果

2.1 对女子柔道运动员尿液代谢组学的分析

2.1.1 基于1H NMR的尿液代谢组学数据分析

采用1H NMR代谢组学技术对18个尿液样本的1H NMR图谱进行对比分析（图1）。

图1 基于1H NMR的尿液代谢组学图谱Figure 1.1H NMR-Based Map of Urinary Metabonomics

通过化学位移、耦合常数及峰型等数据分析，结合公共数据库HMDB（http：//www.Hmdb.ca/）、BMRB（http：//bmrb.Wisc.edu/）对图谱中主要化合物进行归属，尿液中共指认24 种化合物，主要包含有机酸、氨基酸以及含氮小分子等成分（表1）。

表1 基于1H NMR的尿液代谢组学指认的特征代谢物Table 1 Characteristic Metabolites Identified by 1H NMR-Based Urinary Metabolomics

2.1.2 对尿液代谢组学代谢物1H NMR 积分数据的多元统计分析

为直观分析样本之间的差异，采用PCA 散点图观察样本的分离趋势，可以看出样本之间明显分离的状况。除2 号样本外，其余17 个样本都具有聚类特征，可分为3 个组别（A 组、B 组、C 组）。采用PLS-DA 分析，得到除2 号样本外的其余17 名运动员尿液代谢组学样本的得分图，发现17 名运动员的尿液代谢组学样本存在明显区分（图2）。根据图2，可将17 名运动员分为3 个组别，即编号为6、7、8、9 的运动员为A 组，编号为10、11、12、13、14、16、18 的运动员为B 组，编号为1、3、4、5、15、17 的运动员为C 组。

图2 PLS-DA分析得分图Figure 2.Score Plot of PLS-DA Analysis

2.2 不同组别女子柔道运动员代谢物特征与运动训练状态监测评定

2.2.1 运动员尿液代谢组学1H NMR指认代谢物的差异性

据尿液代谢组学代谢物1H NMR 积分数据的多元统计分析的分组情况，对各组中每位运动员所指认的24 种代谢物的峰面积值进行单因素方差分析，两两比较组间的差异性。统计分析表明，部分组间代谢物峰面积值存在显著差异性（P＜0.05；表2）。

表2 3个组别间具有统计学意义的尿液代谢组学代谢物峰面积值比较Table 2 Comparison of Instatistically Significant Peak Area Value of Urinary Metabolomics in the Three Groups

代谢物缬氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸、胆碱峰面积值在A组与B 组间、A 组与C 组间存在差异性（表2）。由均值差可见，A 组的缬氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸、胆碱峰面积值较B 组、C 组更高。牛磺酸峰面积值在A 组与B 组间、B 组与C 组间存在差异性。由均值差可见，B 组的牛磺酸峰面积值较A、C 组更高。此外，在A 组与C 组间，代谢物柠檬酸、肌酸酐峰面积值存在差异性，而在B 组与C 组间，代谢物丙酮酸、胍基乙酸峰面积值存在差异性。

2.2.2 运动员运动训练状态监测心理量表评定值的差异性

计算17 名女子柔道运动员《运动训练状态监测量表》调查结果。根据运动员尿液代谢组学分组情况，将运动员运动训练状态监测各分量表所得分值在3 个组别间进行统计分析。运用单因素方差分析方法，对各分量表评分进行两两比较，发现在心理疲劳分量表上，3 个组别间存在差异性（表3）。

心理疲劳分量表得分在A 组和B 组间存在显著差异性（P＜0.01；表3）；A 组和C 组间，存在差异性（P＜0.05）。但B 组和C 组间不存在差异性。由均值差可见，A 组均值较B 组和C 组均值更大，故A 组在心理疲劳上较B 组、C组更明显。而B 组和C 组在心理疲劳上无统计学差异。探究3 个组别运动员运动训练状态监测的评定值（表4），发现A 组运动员在心理疲劳和自我调节分量表得分较高，可评价其为心理疲劳状态，且运动员在进行自我心理调节。B 组、C 组运动员在心理疲劳分量表所得分值相对较低，不评定其为心理疲劳状态。

表4 3个组别运动员运动训练状态监测各分量表均值Table 4 Mean Values of Each Subscale of Exercise Training Status Monitoring in Three Groups

3 分析与讨论

3.1 女子柔道运动员尿液代谢组学代谢物核磁指认结果分析

代谢组学的发展与生命科学的发展有关，其考察生物体系受到刺激或扰动后的代谢产物变化或其随时间的变化情况。代谢组学基于分子生物学的发展，是反映机体物质代谢末端一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的相对分子质量小于1 000 的内源性小分子化合物的集合。代谢组学中代谢物的数量庞大，可以客观地反映人体受外界影响所产生的变化。尿液是机体代谢物排出的主要形式，故通过测试尿液中的代谢产物获取到的数据，可精准反映机体代谢状况。

代谢组学核磁共振技术基于具有自旋性质的原子核，在核外磁场的作用下吸收射频辐射，产生能级跃迁，以得到核磁共振波谱，常用的波谱包括氢谱、碳谱、氮谱等，其中氢谱是目前研究较为充分的波谱。通过化学位移、耦合常数及峰面积等数值来反映代谢物的特征。采用数学统计手段及数据分析方法得出分布图谱，客观反映样本代谢物在群组中的分布特征，有共性的样本具有聚类特征。

根据17 名女子柔道运动员的代谢物PLS-DA 分析得分图，将具有聚类特征的样本分为A 组、B 组和C 组，各组间样本的代谢物差异性反映了不同组别运动员的代谢状况。由于受到核磁共振波谱分析技术的影响，使得对代谢产物归属与识别受限。本研究共指认出了24 种代谢物，峰面积值可反映样品中各组分的相对含量，对所指认的24 种代谢物峰面积值进行组间比较，可了解不同组别间代谢物相对含量的差异性，这些差异性与各组运动员的机能代谢状态相关。未经指认的代谢物在不同组别间的差异性，也是影响各组运动员机能状态的重要因素。

3.2 女子柔道运动员尿液代谢组学代谢物与运动训练状态评定的相关性

运动员的运动训练状况可通过评定机体的生理生化指标和心理指标进行运动监测，生理生化指标可在客观上反映运动员生理机能对运动负荷的适应性变化。运用代谢组学方法研究运动训练代谢物特征，可从物质代谢层面分析运动员对运动负荷的反应以及运动疲劳的状态。姚晓丹等（2017）的研究认为，代谢组学更全面、敏感、客观地反映了运动员训练和赛后机能的代谢状况，有利于早期发现过度疲劳、过度训练等问题。根据心理学指标对运动员心理状况进行客观评价，反映出其对运动负荷的承受能力。由于没有对运动员进行精确、有规律地监测以及未建立个体的基线水平或“正常范围”，部分学者认为心理学指标有时比生理生化指标能够更早、更有效地确定过度训练（张力为 等，2010）。将生理学方法和心理学方法相结合，可进一步认识到多因素、多层次交互作用的重要性（张力为，2005）。

基于女子柔道运动员尿液代谢组学代谢物PLS-DA 分析得分图分组情况，对运动员心理量表评价得分在不同组别间进行组间比较，反映出不同组别间运动员运动训练状态的差异性。研究发现，在运动训练状态监测心理量表的8 个分量表中，心理疲劳量表在A 组与B 组、A 组与C 组间存在明显的差异性，且A 组得分较B 组、C 组更高，故A 组运动员在运动训练后心理疲劳较B 组、C 组更明显。因此，运动员尿液代谢组学指认出的代谢物可能与运动员运动训练状态监测的心理疲劳程度相关。

将不同组别运动员尿液代谢组学代谢物的峰面积值在组间进行逐一比较分析，发现心理疲劳明显的A 组，其代谢组学代谢物缬氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸、胆碱相对含量较B、C 组更高。这些代谢物涉及到了氨基酸代谢、物质有氧氧化等代谢途径。从代谢途径上，将运动员运动训练后代谢反应特点与运动员运动训练心理状态联系在一起。

3.3 女子柔道运动员代谢组学代谢物的特点与机体的运动应激-适应

对女子柔道运动员运动训练期间尿液代谢组学特点进行研究，发现A 组运动员的尿液代谢组学代谢物在缬氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸、胆碱上较其他组别存在一定差异性，其代谢物相对含量更高。这可能是运动员由于运动应激，受内分泌影响，使机体代谢活动增加，从而适应运动的生理反应，这与高浩恩等（2019）的研究结果一致，即在运动训练中，高强度间歇性训练组和中等强度持续训练组在胆碱、谷氨酰胺、支链氨基酸特异性上有所增加，为其对训练的代谢所产生的适应性变化。

胆碱由丝氨酸和甲硫氨酸在体内代谢合成。丝氨酸脱羧后生成乙醇胺，乙醇胺由S-腺苷甲硫氨酸获得3 个甲基即可合成。在机体胆碱与乙酰辅酶A 合成乙酰胆碱，而乙酰胆碱是中枢神经系统胆碱能神经递质。由于运动应激，机体胆碱水平有所提高。黄彩华等（2011）的研究表明，格斗项目运动员具有较高的迷走神经活性。故运动员代谢物胆碱的生成可能与其对柔道运动项目的适应性有关。Gonzales 等（2013）的研究表明，中等强度运动使胆碱特异性增加，机体胆碱水平间接性地反映了机体对运动的适应。

运动中补充胆碱可以改善机体代谢，提高运动能力。陈秀英（2004）认为，胆碱补充可使中枢乙酰胆碱的相关机制得以改善，中枢神经系统乙酰胆碱的合成受血浆胆碱供应的限制。Qolizadeh等（2011）在关于胆碱对运动中脂质代谢影响的研究中发现，在长时间的运动训练中，补充胆碱可以促进机体脂肪代谢生成游离脂肪酸，也可促进游离脂肪酸代谢生成β-羟丁酸，从而促进脂类物质供能，节约糖类物质及促进运动后机体糖原的合成，进一步促进机体的恢复。

机体谷氨酰胺的生成是固定无机氮原子，经代谢将无机氮原子固定为氨基的过程。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化作用下，还原氧化生成谷氨酸。谷氨酸在谷氨酰胺合成酶的催化作用下，将无机氮原子固定为酰胺基生成谷氨酰胺。Swiatkiewicz 等（2017）对谷氨酰胺的研究表明，运动可使机体谷氨酰胺功能被激活。谷氨酰胺是中枢兴奋性递质，在神经系统突触间进行谷氨酰胺-谷氨酸循环。运动时，大脑区域被激活而增强了谷氨酰胺-谷氨酸循环的周期。例如，大鼠在跑步机上进行力竭运动后，对小脑、纹状体和海马体中提取物使用磁共振扫描仪，记录1H NMR 谱，研究运动对谷氨酰胺-谷氨酸的影响。这种力竭运动时谷氨酰胺的变化具有一定的统计学意义。该研究认为，在大鼠的小脑和海马体中发现谷氨酰胺的信号有所增强，可能是机体功能被激活所致。谷氨酰胺是机体氨的载体，是氨在机体内安全转运的形式。谷氨酰胺对机体具有对抗自由基、提高免疫机能以及延缓疲劳的作用。Koo 等（2014）的研究表明，相对于安慰剂组和支链氨基酸组，谷氨酰胺的补充在恢复阶段对减少疲劳因子具有积极的影响。

缬氨酸与亮氨酸、异亮氨酸合称为支链氨基酸（branched-chain amino acids，BCAA），为机体的必需氨基酸。BCAA 可在骨骼肌中被氧化，其分解代谢产物进入三羧酸循环，进一步实现有氧氧化或糖异生。缬氨酸在机体代谢产生琥珀酰辅酶A，其为机体三羧酸循环的中间物质，在琥珀酸酶的作用下，生成琥珀酸和辅酶A。琥珀酸在三羧酸循环中彻底代谢后生成CO2和H2O，并伴随能量的生成。

因此，在运动训练过程中，运动员通过对运动负荷的应激，达到机体代谢机能对运动的适应。通过提高运动员胆碱、谷氨酰胺、缬氨酸水平，可提高整体运动能力。运动负荷的强度决定了应激的程度和机体代谢的特点（张蕴琨 等，2014），由于运动负荷强度的增加，机体应激程度也随之增加。当身体机能不能维持特定的运动强度时，即出现了运动性疲劳。因此，运动疲劳是评价运动训练负荷的指标。应激也是所有心理疲劳的共同诱因（张力为 等，2006）。在运动人体科学研究领域，代谢组学研究也被应用于生理和心理应激方面（马海峰 等，2015）。

对女子柔道运动员代谢组学特点和运动训练心理监测评价进行分析，发现A 组运动员心理疲劳明显，且运动员自我心理调节评定值较高，其代谢物水平由于自我调节运动应激而得以提高。这可能是由于运动员在运动训练后，在生理指标上持续保持对运动负荷的适应性，从而产生了机能水平提高的生理反应，但从运动员运动训练状态监测评价来看却已出现了心理疲劳状态。通过分析心理疲劳指标和生理代谢物质指标，合理地评价运动负荷对运动员机能状态的影响，是值得进一步研究的课题。

4 结论

基于1HNMR 代谢组学技术，对运动员尿液代谢组学代谢物特点进行分析，可以从整体上全面、客观地反映出运动员在运动训练后机体的物质代谢与能量代谢状况。对运动员尿液代谢组学特征进行聚类分析，可以反映运动员对运动训练负荷产生的不同代谢机能状态，对指导运动训练具有一定的理论意义。

从运动员在运动训练后的机体代谢物角度，分析了运动员机体机能对运动训练负荷的运动应激-适应与运动员较早出现的心理疲劳间的关联性。运用代谢组学技术，可对运动员生理机能进行监测及评价运动训练负荷。