lncRNA SNHG1对乳腺癌细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化的影响及其机制

邓林 吴清兰 宋军莹 高笑 肖欢欢 张丽 曹奕 侯琳

(青岛大学,山东 青岛 266071 1 基础医学院生物化学与分子生物学系;2 药学院;3 生物医学实验中心)

乳腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤,同时也是导致女性死亡的主要原因［1］。手术、化疗和放疗均为目前乳腺癌的主要治疗方式,但乳腺癌的复发率以及转移率依然很高［2］。因此,寻找乳腺癌发病的潜在机制和有效的治疗靶点,是改善患者预后的关键所在。

长链非编码RNA(lncRNA)是长度超过200个核苷酸并且不能编码蛋白质的一种RNA［3］,其可通过多种途径参与细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学过程的调控,与肿瘤的发生密切相关［4-5］。研究发现lncRNASNHG1在结直肠癌组织内表达上调,与肿瘤转移和分期相关,下调SNHG1的表达在体外和体内均可以显著抑制结直肠癌细胞的生长［6］;SNHG1在胃癌中发挥癌基因功能,可以影响胃癌细胞的增殖和上皮-间质转化(EMT)过程［7］。微RNAs(miRNAs)是一种长度大约为22个核苷酸的非编码RNA,lncRNA可调控miRNA表达,与肿瘤发生相关［8-9］。研究显示,miR-641可通过抑制乳腺癌细胞生长和侵袭来调节乳腺癌的进程［10］。目前,乳腺癌中关于SNHG1功能和机制的研究依然很少。本研究通过RNA干扰技术及双荧光素酶实验,探讨了SNHG1靶向调控miR-641的分子机制及对乳腺癌细胞迁移、侵袭和EMT的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

SNHG1小干扰RNA(si-SNHG1)、miR-NC、miR-641 mimics、si-NC、anti-miR-641、anti-miR-NC(上海吉玛制药技术有限公司),Trizol试剂、RNA逆转录试剂盒以及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒(南京诺维赞生物有限公司),兔抗人上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司),LipofectamineTM2000转染试剂(美国Invitrogen公司),双荧光素酶活性检测试剂盒(上海全式金生物技术有限公司)。

1.2 细胞培养

细胞系MCF-10A、MCF-7、BT-549、MDA-MB-231和MDA-MB-468均购自中国科学院细胞库。将MCF-10A、MCF-7、BT-549、MDA-MB-231以及MDA-MB-468细胞分别置于含体积分数0.10的胎牛血清的DMEM/F12和DMEM中,在37 ℃、含体积分数0.05的CO2恒温培养箱中培养至对数生长期用于后续实验。

1.3 RT-qPCR检测lncRNA SNHG1和miR-641表达

收集青岛大学附属肿瘤医院20例病理确诊为乳腺癌患者的癌组织和癌旁正常组织,置于标本储存液中,-80 ℃保存备用。使用Trizol试剂提取乳腺癌组织、癌旁正常组织及细胞(MCF-10A、MCF-7、BT-549、MDA-MB-231和MDA-MB-468)中的总RNA。然后用微量核酸定量仪进行RNA浓度检测,并将RNA反转为cDNA,根据试剂盒说明进行RT-qPCR。对于miRNA,通过茎环法合成cDNA,以U6作为miRNA内参照。SNHG1的内参照为GAPDH。利用2-△△CT方法计算目的基因的相对丰度。继而选择SNHG1表达较正常乳腺上皮细胞MCF-10A细胞基因差异最显著(P值最小)的乳腺癌细胞BT-549进行后续实验。引物名称及其序列详见表1。

表1 引物名称及其序列

1.4 BT-549细胞转染和分组

处于对数生长期BT-549细胞接种于6孔板中,待细胞汇合度约达60%时,分为A～D组,分别用LipofectamineTM2000转染试剂将si-NC(A组)、si-SNHG1(B组)、si-SNHG1与anti-miR-641-NC(C组)、si-SNHG1与anti-miR-641(D组)转染BT-549细胞,6 h后换液。继续培养36 h,RT-qPCR方法检测A、B组细胞中SNHG1及miR-641表达水平,收集各组细胞用于后续实验。

1.5 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭能力

取A～D组培养36 h的BT-549细胞,以无血清培养基重悬细胞后,于Transwell小室上室加入100 μL(约1×104个细胞)细胞悬液,下室加入600 μL含体积分数0.20的血清培养基。细胞培养24 h后,停止实验。去除小室中培养基,将迁移过膜的细胞用40 g/L的多聚甲醛固定20 min,PBS冲洗3次,再用1 g/L的结晶紫染色15 min。随后用棉签轻柔擦除未迁移过膜、残留于上室的细胞,PBS冲洗3次,晾干,显微镜下观察并计算迁移细胞数量。无血清DMEM培养基与基质胶按8∶1比例混合,随后将稀释的基质胶均匀加入到小室上室内,晾干。取A～D组培养36 h的BT-549细胞悬液加入到小室上室内,后续操作同细胞迁移步骤,最后显微镜下观察并计算侵袭细胞数量。

1.6 Western blot方法检测细胞中的E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达量

取A～D组培养36 h的BT-549细胞,RIPA将细胞充分裂解后,收集裂解液,4 ℃下12 500 r/min离心20 min。将上清液转移至新的离心管中,加入1/4体积的5×loading buffer,充分振荡混匀,煮沸10 min,收集蛋白样本。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白,并转移到PVDF膜上。用体积分数0.05的脱脂牛奶在室温下封闭膜2 h后,一抗4 ℃下孵育过夜,TBST洗膜3次,每次10 min。再用辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下与膜孵育1 h,洗膜,暗室中曝光显影。利用Image J软件分析蛋白灰度值,并计算目的蛋白的相对表达量。

1.7 双荧光素酶报告基因实验检测SNHG1以及miR-641的靶向关系

通过Starbase v2.0数据库检索发现,SNHG1与miR-641存在互补序列。然后合成含miR-641结合位点的SNHG1野生型(SNHG1-WT)序列以及相应突变型(SNHG1-MUT)序列,并被克隆到pSI-check2质粒中。处于对数生长期BT-549细胞在24孔板中培养,当细胞汇合度约达60%时,将SNHG1-WT与miR-641 mimics(E组)、SNHG1-WT与miR-NC(F组)以及SNHG1-MUT与miR-641 mimics(G组)、SNHG1-MUT与miR-NC(H组)通过LipofectamineTM2000共转染BT-549细胞,培养48 h后,弃培养基,PBS冲洗2次,加入裂解液室温裂解10 min,4 ℃下离心,取上清液检测荧光素酶活性,相对荧光素酶活性以萤火虫与海肾荧光素酶活性比值表示。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 乳腺癌组织中lncRNA SNHG1、miR-641的表达情况

RT-qPCR检测结果显示,SNHG1和miR-641在癌旁正常组织中相对表达量分别为1.01±0.01、0.98±0.125,而在乳腺癌组织中的相对表达量分别为2.15±1.08、0.49±0.12。与癌旁正常组织相比,乳腺癌组织中的SNHG1表达明显升高(t=4.81,P<0.05),而miR-641表达显著降低(t=7.96,P<0.05)。

2.2 乳腺癌细胞中lncRNA SNHG1、miR-641的表达情况

MCF-10A及4种乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和BT-549)中SNHG1以及miR-641表达量比较差异均有显著性(F=36.23、79.32,P<0.05),其中与MCF-10A相比,4种乳腺癌细胞中SNHG1的表达均上调(t=8.11～10.79,P<0.05),miR-641表达下调(t=9.16～11.17,P<0.05);SNHG1以及miR-641在4种乳腺癌细胞之间相比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。选择SNHG1表达较MCF-10A细胞基因差异最具有显著性(P值最小)的乳腺癌细胞BT-549进行后续实验。

表2 SNHG1和miR-641在正常乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞中的表达

2.3 下调lncRNA SNHG1的表达对于细胞中SNHG1、miR-641的影响

A组与B组中SNHG1相对表达水平分别为1.00±0.06和0.34±0.02,B组中SNHG1水平显著降低(t=22.16,P<0.05)。A组与B组中miR-641相对表达水平分别为1.00±0.06、2.29±0.10,B组中miR-641的表达水平显著升高(t=19.45,P<0.05)。

2.4 下调lncRNA SNHG1表达对BT-549细胞迁移、侵袭和EMT的影响

Transwell实验结果显示,与A组相比较,B组BT-549细胞迁移、侵袭过膜细胞数均明显减少(t=9.08、5.80,P<0.05)。Western blot方法检测结果显示,与A组相比较,B组BT-549细胞EMT相关蛋白N-cadherin以及Vimentin的表达均明显下降(t=3.95、5.27,P<0.05),而E-cadherin蛋白表达明显升高(t=7.43,P<0.05)。见表3。

表3 各组细胞迁移、侵袭细胞数及EMT相关蛋白表达量比较

2.5 下调miR-641可逆转沉默SNHG1对BT-549细胞迁移、侵袭与EMT的影响

与C组相比,D组BT-549细胞迁移、侵袭过膜的细胞数量显著增加(t=9.19、7.76,P<0.05),N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显升高(t=9.86、13.83,P<0.05),而E-cadherin蛋白表达显著降低(t=3.59,P<0.05)。见表3。

2.6 双荧光素酶活性分析

实验结果表明,E组与F组的荧光素酶活性分别为0.47±0.06、1.00±0.08,E组荧光素酶活性显著降低(t=8.37,P<0.05);G组与H组的荧光素酶活性分别为0.97±0.15、1.01±0.08,两组荧光素酶活性比较无明显差异(P>0.05)。

3 讨 论

乳腺癌作为一种高异质性疾病,复发率和转移率很高,整体治疗效果不理想,所以寻找新的治疗靶点以降低乳腺癌患者的病死率,仍是公众关注的重点［11-12］。lncRNA的失调与多种恶性肿瘤(包括乳腺癌)的发生密切相关［13］。因此,lncRNA在肿瘤中的功能和调控机制已经成为当前的研究热点,以发现肿瘤诊断和治疗的新靶点。

SNHG1由8个核仁内小RNA组成,位于人类11号染色体上,具有11个外显子。SNHG1与肿瘤的发生密切相关,在多种肿瘤组织中高表达,促进肿瘤的发生［14-15］。大量研究显示,lncRNA在调控乳腺癌细胞迁移和侵袭等生物学过程中起着重要的作用。例如lncRNAAC073352.1可以结合Y-框结合蛋白1(YBX1)促进乳腺癌迁移、侵袭和血管生成［16］;SNHG1在肝癌细胞中高表达,并通过激活AKT通路介导索拉非尼耐药,并与患者预后不良有关,对肝癌具有潜在诊断价值［17］。

本研究首先收集了20例乳腺癌组织和其癌旁的正常组织,检测发现SNHG1在乳腺癌组织中明显上调。随后,利用RT-qPCR方法进行进一步验证SNHG1在乳腺癌细胞水平的表达情况,相比较于人正常乳腺上皮细胞MCF-10A,4种乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和BT-549)中SNHG1表达均上调。为了探索SNHG1在乳腺癌中的作用,选择SNHG1表达量上调最为显著且具有迁移能力的BT-549细胞作为研究对象。通过BT-549细胞转染SNHG1的小干扰RNA下调其表达量,随后Transwell实验检测SNHG1表达对BT-549细胞迁移和侵袭能力的影响。结果显示,下调SNHG1表达后,细胞迁移、侵袭过小室膜的数量显著减少,提示SNHG1可促进乳腺癌细胞的迁移与侵袭。为了探明SNHG1促进乳腺癌发生的具体分子机制,通过对Starbase v2.0数据库检索发现SNHG1与miR-641存在互补结合序列,同时RT-qPCR结果显示在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中SNHG1呈现高表达,miR-641呈现低表达,提示SNHG1可能通过靶向miR-641促进乳腺癌的进展。RT-qPCR检测结果也显示,在BT-549细胞中下调SNHG1以后miR-641的表达升高。随后,在BT-549细胞中共转染SNHG1的小干扰RNA以及anti-miR-641,发现敲低miR-641后可以逆转下调SNHG1对BT-549细胞侵袭和迁移的抑制作用,证实了SNHG1可通过miR-641促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。

EMT是胚胎发育中极其重要的一个过程,能够让细胞在胚胎发育过程中在上皮和间质状态之间转换。EMT也是促进肿瘤细胞转移的主要原因之一［18-19］。在EMT发生过程当中,上皮标志物例如E-cadherin表达降低,而间质标志物如N-cadherin和Vimentin表达升高［20］。发现SNHG1在前列腺癌中通过与hnRNPL竞争性结合阻止E-cadherin翻译,进而促进EMT过程［21］。本研究显示,下调SNHG1可以提高BT-549细胞中E-cadherin蛋白表达水平,降低N-cadherin以及Vimentin蛋白表达,抑制了EMT过程,而敲低miR-641可以逆转由下调SNHG1表达对BT-549细胞EMT过程的抑制作用。多项研究表明,lncRNA可以作为miRNA的“海绵”,从而调节肿瘤的生物学功能［22］,lncRNAMCM3AP-AS1在肝癌中靶向负调控miR-194-5p,促进FOXA1的表达,进而调节肝癌细胞增殖、迁移和侵袭［23］。研究发现,miR-641在神经胶质瘤中低表达,lncRNACOX10-AS1作为miR-641的“海绵”调节神经胶质瘤增殖、迁移和侵袭过程［24］。还有研究表明miR-641可以调控乳腺癌进程,下调miR-641可以靶向SRCAP抑制乳腺癌细胞生长、侵袭和EMT过程,提示miR-641可能作为治疗乳腺癌的潜在靶点［10］。本研究利用双荧光素酶实验进一步验证SNHG1能否靶向调控miR-641,结果显示miR-641可以显著抑制野生型SNHG1的荧光素酶活性,对突变型SNHG1的荧光素酶活性无影响,提示SNHG1可以靶向调控miR-641。

综上所述,SNHG1在乳腺癌组织和细胞中高表达,SNHG1可通过靶向调控miR-641促进乳腺癌细胞侵袭、迁移以及EMT过程。SNHG1/miR-641轴的研究为乳腺癌的靶向治疗提供了新的可能。然而,本研究尚未探究miR-641下游的分子机制,且未进行体内实验验证SNHG1/miR-641轴对乳腺癌的影响,后续将对此进行深入的研究。

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学医学部伦理委员会的审核批准(文件号QDU-HEC-2022259)。所有试验过程均遵照《人体医学研究的伦理准则》的条例进行。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

作者声明：邓林、吴清兰、宋军莹、高笑、肖欢欢、张丽、曹奕、侯琳参与了研究设计;邓林、侯琳参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。