中国被毛孢醇提物通过MAPK/NF-κB 通路双向调控巨噬细胞的免疫功能研究

李琪琪，王雪娇，初英杰，刘 霞，禹艳丽，王 遥*，贾 鑫*

1. 北京中医药大学中药学院，北京 100027

2. 北京中医药大学生命科学学院，北京 100027

冬虫夏草Cordycepssinensis(Berk.) Sacc.属于麦角菌科真菌，是我国特有的中草药，并被用于肾虚精亏、阳痿遗精、腰膝酸痛、久咳虚喘等症[1-3]。研究表明，冬虫夏草具有调血脂、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种药理学活性。中国被毛孢是冬虫夏草的无性型菌株，也是其药理活性成分的主要来源和唯一代表性真菌。

冬虫夏草对机体的免疫调节及其药理功能发挥具有重要意义。冬虫夏草可发挥类似于免疫佐剂的功能，被用于改善移植病变和器官移植患者免疫力低下的辅助治疗[4]。研究发现，虫草水提取物具有治疗和改善辐射诱导的免疫抑制的功效[5]。此外，冬虫夏草表现出显著的抗炎作用，虫草水提取物通过抑制趋化因子表达，在免疫球蛋白 A（immunoglobulin A，IgA）肾病中发挥抗炎功能；虫草水提取物通过抑制细胞凋亡和促炎因子表达，从而减轻肝损伤和肝脏的局部炎症[6-8]。虫草多糖和虫草素是冬虫夏草（中国被毛孢菌丝体）水提物中的主要药效成分[9-10]。其中，虫草多糖可通过抗氧化和调血脂作用，发挥对非酒精性脂肪肝ApoE-/-小鼠的保护作用，并有效缓解博来霉素引起的小鼠肺纤维化[11-16]。虫草素通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信号通路和抑制信号转导和转录激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）磷酸化抑制过度炎症浸润，从而有效改善非酒精性脂肪肝[17-18]。然而，目前关于冬虫夏草醇提取物的免疫药理功能仍鲜有报道，探究其醇提物中的主要成分和免疫药理作用具有现实意义。本研究利用巨噬细胞和小鼠模型，探究中国被毛孢醇提物（Hirsutellasinensisalcohol extract，HSAE）的免疫调控功能和机制。

1 材料

1.1 细胞

小鼠巨噬细胞RAW264.7 购自美国ATCC。

1.2 动物

SPF 级C57BL/6 雄性小鼠，体质量18～20 g，6～8 周龄，购自斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0010。小鼠饲养于温度18～22 ℃、湿度50%～60%、12 h 光暗交替的环境中，自由进食饮水。所有动物实验和研究经北京中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号BUCM-2022-041303-2016），并严格按照动物实验相关章程执行。

1.3 药品与试剂

HSAE 冻干粉由云南大学与云南白药集团股份有限公司提供；去离子水为实验室Milli-Q（18.2 MΩ）自制超纯水、DMEM 高糖培养基（批号C11995500CP）、胎牛血清（批号2358184P）、BCA蛋白定量试剂盒（批号23227）、质谱级乙腈及甲酸购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批号D4540）、20×TBST溶液（批号T1082）、5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（批号T1070-500 mL）购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8 细胞增殖-毒性检测试剂盒（批号CK04）购自东仁化学科技（上海）有限公司；Trizol 试剂（批号15596018）购自Invitrogen 公司；Evo M-MLV RT Kit（批号AG11711）、0.25%胰蛋白酶/EDTA 细胞消化液（批号T1300）、SYBR®Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（批号AG11701）购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；都氏试剂（批号R22785-100 mL）、绵羊红细胞（4%，批号R21900-100 mL）、补体（正常豚鼠血清，批号S27068-1 mL*10）、匹多莫德（批号S80183-5 g）购自上海源叶生物科技有限公司；PAGE 凝胶快速制备试剂盒（批号PG212）购自上海雅酶生物医药科技有限公司；超敏ECL 发光液（批号WBKLS0500）购自美国Millipore 公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号60004-1-Ig）购自英国Abcam 公司；c-Jun 氨基末端激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）抗体（批号9252S）、p-JNK抗体（批号 9251S）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）抗体（批号9102L）、p-ERK 抗体（批号9106S）、p38 抗体（批号9212S）、p-p38 抗体（批号9211S）购自美国CST 公司；HRP 标记的山羊抗兔IgG 抗体（批号M21002S）、HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 抗体（批号M21001S）购自艾比玛特生物医药（上海）有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批号L4391）购自美国Sigma 公司。

1.4 仪器

CFX96 型荧光定量PCR 仪、T100 型PCR 仪、SCl-VS 型可调式混匀仪（美国Scilogex 公司）；PowerPac 型基础电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；UPLC-QE-Orbitrap-MS 质谱仪（Xcalibur 质谱工作站）、NANODROP ONEc 型分光光度计、Sorvall™Legend™ Micro 21R 型微量离心机、1300 Series A2型生物安全柜、Heracell 150i 型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；SpectraMax i3x 型多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]；Mill-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）；ZHCH-C1115B型超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）；DK-8D 型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）；SK-L180-Pro 型数控线性摇床[大龙兴创实验仪器（北京）股份公司]；EPS-300 型数显式稳压稳流电泳仪（上海天能公司）；CKX53 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 药物配制

取HSAE 冻干粉100 mg，加入1 mL DMSO 充分振荡混匀，即为100 μg/μL 母液，分装后储存于-80 ℃待用。

2.2 细胞培养

RAW264.7 细胞用含1%青霉素-链霉素混合液和10%胎牛血清的DMEM 培养基，在5% CO2、37 ℃的培养箱中培养，待细胞密度为90%左右时，按1∶5 的比例进行传代。

2.3 液质联用色谱-质谱分析

2.3.1 样品溶液的制备 精密称取HSAE 冻干粉20 mg 于1.5 mL EP 管，加入1 mL 甲醇涡旋溶解，12 000 r/min 离心10 min，取上清液，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得样品溶液。

2.3.2 液相条件 Waters HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～30 min，5%～95% B。柱温40 ℃；体积流量0.2 mL/min；进样量2 μL。

2.3.3 质谱条件 离子源为电喷雾电离源（ESI）；正负离子同时扫描；扫描模式为Full scan/dd MS2，扫描范围m/z100～1500；毛细管温度350 ℃；正离子模式喷雾电压3500 V，负离子模式喷雾电压3000 V；鞘气35 arb，辅助气15 arb；标准化碰撞能为35%；一级质谱分辨率为70 000，二级质谱分辨率为17 500。

2.4 CCK-8 法检测细胞增殖活性

RAW264.7 细胞以9×104/孔接种于96 孔板，培养箱中过夜使细胞完全贴壁且细胞密度为80%～90%。用DMEM 完全培养基稀释HSAE 母液至相应质量浓度（1×10-4、1×10-3、0.01、0.1、1、10、100、1000、1×104μg/mL），将稀释好的HSAE 溶液加入细胞中，每孔100 μL，同时设置仅加入DMEM 完全培养基（无细胞）的空白组和加入1%DMSO 的溶剂对照组（有细胞），每组设置3 个复孔，于5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养24 h；每孔加入10 μL CCK-8 试剂，于培养箱中孵育30 min，待培养基变为橙黄色后，酶标仪测定450 nm处的吸光度（A）值，计算细胞存活率，绘制细胞增殖曲线。

2.5 细胞吞噬活性检测

RAW264.7 细胞以9×104/孔接种于96 孔板，培养箱中过夜使细胞完全贴壁且细胞密度为80%～90%。用DMEM 完全培养基稀释HSAE 母液至相应质量浓度（1×10-4、1×10-3、0.01、0.1、1、10、100、1000、1×104μg/mL），分别用稀释好的HSAE溶液和LPS（500 ng/mL，阳性对照）处理细胞，每组设置3 个复孔，于5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养24 h 后，弃去上清，每孔加入100 μL 1%中性红溶液，培养箱中孵育1 h，用PBS 洗涤3 次，每孔加入100 μL 细胞裂解缓冲液（无水乙醇-冰醋酸1∶1），4 ℃静置过夜，酶标仪测定570 nm 处的A值，计算细胞吞噬活性。

2.6 小鼠体内血清溶血素测定实验

将小鼠分为空白组（PBS）、匹多莫德（100 mg/kg）组和HSAE 低、中、高剂量（50、100、200 mg/kg）组，每组5 只。各组小鼠ig 200 μL 相应药物，1 次/d，连续21 d；实验结束前5 d 开始，各组小鼠ip 0.2 mL 绵羊红细胞致敏，直至实验结束，小鼠摘眼球取血后脱颈椎处死。血液放置30 min 后经离心分离得到血清，将血清与生理盐水按1∶500 的比例混匀，吸取0.5 mL 稀释后的血清，与0.25 mL绵羊红细胞混合，在低温下加入0.5 mL 豚鼠血清混合。设置不加血清的对照组，37 ℃恒温箱中孵育30 min，随后立即移至0 ℃冰箱结束反应，3000 r/min离心5 min，取上清液，酶标仪检测540 nm 处的A值。将0.25 mL 绵羊红细胞与3.75 mL 都氏试剂混合后测定A值，代表绵羊红细胞的半数溶血值（half value of hemolysin，HC50）。

2.7 qRT-PCR 检测HSAE 对细胞因子表达的影响

RAW264.7 细胞以4×105/孔接种于24 孔板，过夜培养使其完全贴壁。设置浓度梯度加药和时间梯度加药实验。用DMEM 完全培养基稀释HSAE母液（100 μg/μL）至相应质量浓度（25、50、100、200 μg/mL），加或不加LPS（500 ng/mL）共同孵育2 h，收集细胞。

用DMEM 完全培养基稀释HSAE 母液（100 μg/μL）至200 μg/mL，加或不加LPS（500 ng/mL）共同孵育30、60、90 min，收集细胞。按照试剂盒说明书提取细胞总RNA 并合成cDNA，进行qRTPCR 分析。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，Tnf）、CXC 趋化因子配体10（CXC chemokine ligand 10，Cxcl10）和干扰素β1（interferon beta 1，Ifnb1）的引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.8 Western blotting 检测HSAE 对p-p38、p38、p-p65、p65、p-JNK、JNK、p-ERK 和ERK 蛋白表达的影响

RAW264.7 细胞以8×105/孔接种于12 孔板，过夜培养使其完全贴壁。按“2.7”项下方法给药，过夜培养使其完全贴壁。按“2.7”项下方法给药，收集细胞，使用IP 裂解液使细胞充分裂解，离心后取上清，加入5×Loading Buffer，100 ℃使蛋白变性，BCA 法测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，封闭后加入一抗，4 ℃孵育过夜，室温孵育二抗，显影。

2.9 统计学分析

所有数据使用GraphPad Prism 9.0 软件进行统计学分析，使用单因素方差分析进行组间比较，结果采用±s表示。

3 结果

3.1 HSAE 的成分测定

利用HPLC-MS 技术鉴定分析HSAE 中所含成分，HPLC-MS 基峰图见图1。《中国药典》2020 年版规定腺苷为鉴定冬虫夏草的主要有效成分[21]，HSAE 所含成分主要包含核苷、氨基酸类以及虫草酸等。其中腺苷为核苷类的主要成分，但未鉴定出虫草多糖和虫草素成分（表2）。虫草多糖为极性分子，多包含于水提物成分[9-10]；此外，多个团队也报道冬虫夏草中不含虫草素成分[22-27]。

图1 HSAE 的HPLC-MS 基峰图Fig. 1 HPLC-MS base peak map of HSAE

表2 HSAE 主要成分及分类Table 2 Main components and classification of HSAE

3.2 HSAE 对巨噬细胞活性的影响

使用CCK-8 法检测不同质量浓度的HSAE 处理24 h 对RAW264.7 细胞存活率的影响，并绘制量-效关系曲线，计算得到HSAE 对细胞的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）为933.3 μg/mL（图2）。选取5、50、100、200 μg/mL 4 个质量浓度进行后续细胞实验。

图2 HSAE 对巨噬细胞存活率的影响 (±s, n = 3)Fig. 2 Effect of HSAE on survival rate of macrophages(±s, n = 3)

3.3 HSAE 可以增加巨噬细胞的吞噬能力

巨噬细胞吞噬入侵的病原体并递呈抗原，分泌肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β 等促炎细胞因子，从而激活招募多种免疫细胞共同抵抗病原体的入侵。巨噬细胞可吞噬中性红染料，其吞噬能力可通过定量巨噬细胞吞噬中性红后的吸光度变化所反映。在HSAE 或LPS（阳性对照，LPS 具有激活巨噬细胞吞噬的功能）处理后的细胞中加入中性红溶液，1 h 后除去，再将细胞裂解，静置过夜后检测A值的变化。如图3 所示，HSAE 处理能够显著增加巨噬细胞的吞噬能力，并呈剂量相关性（P＜0.01、0.001），其促进吞噬的作用强于阳性对照LPS处理组。

图3 HSAE 对巨噬细胞吞噬能力的增强作用 (±s, n = 3)Fig. 3 Enhancement of phagocytosis of macrophages by HSAE (±s, n = 3)

3.4 HSAE 对小鼠脏器指数和免疫功能的影响

如图4 所示，各给药组小鼠肾、脾和胸腺脏器指数均显著升高（P＜0.05、0.01、0.001），匹多莫德组和HSAE 低剂量组肝脏器指数显著升高（P＜0.05、0.01），各给药组均可增强小鼠的血清溶血素水平。

3.5 HSAE 能激活静息状态下巨噬细胞中免疫因子的表达

促炎细胞因子的分泌对于维持和调节免疫系统稳态至关重要。因此，考察HSAE 单独刺激时对细胞因子表达的影响，如图5 所示，与对照组比较，HSAE 诱导Tnf、Cxcl10和Ifnb1基因表达增加（P＜0.01、0.001），且呈剂量和时间相关性，表明HSAE能够促进静息巨噬细胞中促炎细胞因子的表达。

图4 HSAE 对小鼠的抗炎及免疫调节作用 (±s, n = 5)Fig. 4 Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of HSAE on mice (±s, n = 5)

图5 HSAE 诱导巨噬细胞中相关细胞因子基因的表达 (±s, n = 3)Fig. 5 HSAE induced cytokine gene expressions in macrophages (±s, n = 3)

3.6 HSAE 能抑制LPS 诱导炎症激活的巨噬细胞中免疫因子的表达

LPS 是一种常用的细菌内毒素，巨噬细胞识别LPS 后，激活细胞信号转导，转录并释放多种促炎细胞因子，激活炎症反应。HSAE 与LPS 共处理后，检测细胞中促炎细胞因子与干扰素的表达，如图6所示，与单独LPS 刺激组相比，在RAW264.7 细胞中HSAE 与LPS 共处理后，Tnf、Cxcl10、Ifnb1mRNA表达随着药物质量浓度升高而下降（P＜0.05、0.01、0.001），抑制效果呈时间相关性。以上结果表明，HSAE 可以抑制炎症激活后巨噬细胞中促炎细胞因子和干扰素的mRNA 表达，从而发挥其抗炎效应。

图6 HSAE 抑制LPS 诱导的炎症因子表达 (±s, n = 3)Fig. 6 HSAE inhibited expressions of inflammatory factors induced by LPS (±s, n = 3)

3.7 HSAE 通过调控丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路介导免疫双向调控功能

为了探究HSAE 的免疫调控功能的分子机制，采用Western blotting 检测MAPK 通路关键因子JNK、ERK、p38 和NF-κB 通路的重要亚基p65 的磷酸化变化。如图7-A 所示，静息状态下的RAW264.7 细胞中，随着HSAE 质量浓度的升高，细胞中p-JNK、p-ERK 和p-p65 的蛋白磷酸化水平相对逐步增强，与对照组相比具有显著差异（P＜0.05、0.01）；而HSAE 不同时间点处理后，p-JNK、p-ERK 和p-p65 的蛋白磷酸化水平随时间增加而减弱（图7-B）。

图7 HSAE 激活MAPK 通路和NF-κB 通路 (±s, n = 3)Fig. 7 HSAE activated MAPK pathway and NF-κB pathway (±s, n = 3)

如图7-C 所示，在LPS 诱导的炎症激活模型中，加入HSAE 处理不同时间，LPS 激活的p-JNK、p-ERK、p-p38 和p-p65 蛋白磷酸化水平逐步抑制，与LPS 刺激组比较差异显著（P＜0.01、0.001）。以上结果表明，HSAE 的免疫双向调控与其对MAPK通路和NF-κB 通路的调控密切相关。

4 讨论

免疫系统的严密调控是维持人体健康的充分必要条件。机体免疫力低下，其免疫应答不足或不及，可造成病原微生物入侵并在宿主体内增殖、复制，诱发病原感染性疾病。此外，宿主免疫识别病原入侵信号后，激活炎症相关信号通路，诱发炎症反应。适度的炎症反应是机体清除病原微生物的重要方式，然而，当炎症信号过度或持续激活，则会导致炎症性的组织损伤，诱发机体的系统性病变和肿瘤发生。因此，探究冬虫夏草的免疫双向调控功能及其作用的分子机制，具有重要的科学意义和临床应用价值。

巨噬细胞是固有免疫中一类重要的抗原递呈细胞，具有吞噬杀伤病原体和递呈病原体抗原的作用，其通过分泌多种细胞因子，在调控机体的固有免疫和适应性免疫应答中发挥着不可或缺的作用[19-20]。病原体感染或组织损伤时，巨噬细胞通过细胞膜上和细胞质中的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRRs）识别病原体的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），激活MAPK 亚家族的成员，包括ERK、p38 和JNK亚家族以及NF-κB 的磷酸化诱导TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎细胞因子表达，从而发挥调控固有免疫和适应性免疫的功能。

研究表明，虫草多糖单独处理可以诱导巨噬细胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α 等细胞因子的分泌，增强巨噬细胞的吞噬活性[9-10]。本研究发现，HSAE 可以促进静息状态下RAW264.7 细胞的吞噬能力，并显著增加Tnf、Cxcl10等基因的表达。表明HSAE在体外具有明确的免疫激活作用。利用LPS 刺激的巨噬细胞炎症模型，发现HSAE 显著下调Tnf、Cxcl10的mRNA 表达水平，并呈剂量和时间相关性。此外，HSAE 单独处理促进了RAW264.7 巨噬细胞MAPK 和NF-κB 信号通路激活，并在炎症激活后抑制了MAPK 和NF-κB 信号通路关键因子的磷酸化。上述结果与虫草素的免疫双向调控功能的报道一致。

本研究首次阐明HSAE 的双向免疫调控功能，初步发现该活性可能与其对MAPK 和NF-κB 通路的调控有关，为中国被毛孢的临床应用和药理学研究提供了实验数据支撑。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突