血清4型禽腺病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

吴双 　张聪 　袁慧莎 　戴利霞 　林梦舟 　吴植 　朱善元

摘要： 為建立快速检测血清4型禽腺病毒病（Fowl aviadenovirus serotype 4，FAdV-4）的基于TaqMan探针的Quantitative real-time PCR（qPCR）检测方法，本研究根据 Hexon基因序列，设计相关的qPCR特异性引物和探针，经特异性、敏感性和重复性试验以及反应程序等系列优化后，最终建立荧光定量检测方法并应用于临床样品的病原检测。FAdV-4的qPCR结果表明，优化后标准曲线决定系数（R²）为0.998，扩增效率（E）为95.226%，该方法效果良好。利用该方法，除FAdV-4外其他禽类常见病原均未检测到，该方法具有良好的特异性。该qPCR方法检出阳性的最低拷贝数为100个拷贝，而普通PCR方法检出阳性的最低拷贝数为10 000个拷贝，说明其具有良好的灵敏度。组内和组间变异系数均≤0.22%，该方法的重复性较高。对180份从江苏、安徽、江西和广西等省份采集的临床疑似样品进行检测，结果显示，qPCR方法检出率为51.1%，而普通PCR方法检出率为32.8%；同时基于qPCR引物的检出符合率为100.00%，而基于普通PCR特异性引物检出的符合率为82.35%，表明该qPCR方法针对临床疑似样品的检测准确性更高。该方法的建立有助于推动禽腺病毒病的分子流行病学研究和防控。

关键词： 血清 4 型禽腺病毒；荧光定量PCR；临床应用

中图分类号： S831.7 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2023）01-0134-08

Establishment and application of quantitative real-time PCR detection method for fowl aviadenovirus serotype 4 based on TaqMan probe

WU Shuang¹， ZHANG Cong^1，2， YUAN Hui-sha^1，2， DAI Li-xia²， LIN Meng-zhou¹， WU Zhi¹， ZHU Shan-yuan¹

（1.Jiangsu Provincial Key Laboratory of Veterinary Bio-pharmaceutical High-Tech Research， Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College， Taizhou 225300，China；2.Hesheng Food Group Co.， Ltd.， Taizhou 225300，China）

Abstract： To establish rapid detecting method for fowl aviadenovirus serotype 4 （FAdV-4） detection based on quantitative real-time PCR （qPCR） with TaqMan probe， specific primers and TaqMan probe for qPCR were designed based on Hexon gene sequence of FAdV-4 in GenBank. After a series of optimization operations of specificity， sensitivity， repetitive experiments and reaction procedure， the fluorescence quantitative detection method was finally established and was applied to the pathogen detection of clinical samples. qPCR results of FAdV-4 showed that， coefficient of determination （R²） of the optimized standard curve was 0.998， and the amplification efficiency （E） was 95.226%， which indicated that the method had good effect. Other common avian pathogens were not detected except for FAdV-4 by using the detecting method. The lowest copy for detecting sensitivity by qPCR method was 100， while the lowest copy for detecting sensitivity by conventional PCR method was 10 000， which indicated that the qPCR method had good sensitivity. The variation coefficients between and within groups were all ≤0.22%， which showed high repeatability of the method. 180 clinical suspected samples collected from Jiangsu province， Anhui province， Jiangxi province and Guangxi Zhuang Autonomous Region were detected. The results showed that， positive detection rate of qPCR method was 51.1%， while the value of conventional PCR method was 32.8%. The positive detection rate based on qPCR primers was 100.00%， and the value based on conventional PCR specific primers was 82.53%， which revealed that the qPCR method had higher positive detection rate for clinical suspected FAdV-4 sample detection. The establishment of quantitative real-time PCR with TaqMan probe detection method is conducive to promote molecular epidemiological investigation and control of fowl aviadenovirus.

Key words： fowl aviadenovirus serotype 4;fluorescent quantitative PCR;clinical application

禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAdV）属于腺病毒科禽腺病毒属，是无囊膜的双链DNA病毒^[1]。FAdV分为A～E 5个种，1～7、8a、8b、9～11等12个血清型^[2]，其中血清 4 型禽腺病毒致病能力较强，临床表现为心包积液综合征和/或包涵体肝炎，可以垂直传播及水平传播，没有明显的季节性，主要感染3～6周龄的鸡，死淘率高达30%～80%，是目前给养鸡业造成巨大损失的重要病原之一^[3-5]。

然而，目前针对FAdV-4的研究成果较少，能用于临床的有效免疫防控措施更少，国内商品化禽腺病毒灭活苗仅有新流腺三联灭活疫苗。因此，效率高、速度快、特异性强的病原诊断方法对该病的防控十分重要。目前已有的FAdV-4的检测方法有血清学检测、病毒的分离培养、普通PCR等，这些方法存在易出现假阳性、特异性低等缺点^[6]。敏感性好和特异性高是TaqMan探针实时荧光定量PCR（qPCR）方法的独特亮点，因此常被用于病原核酸检测^[7]。由于FAdV-4给养禽业造成日益严重的经济损失且相关检测方法匮乏，因此本研究旨在建立一种能特异针对FAdV-4 Hexon基因的病原快速检测以及病毒载量测定的qPCR方法，为该病的防控提供新方法。

1 材料与方法

1.1 生物材料

特异性验证试验中涉及的生物材料包括商品化活疫苗毒：新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）、传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus， IBV）、鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus， IBDV）、鸡痘病毒（Fowlpox virus， FPV）、传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus， ILTV）。以及本实验室鉴定、分离和保存的毒株：血清4型禽腺病毒（Fowl aviadenovirus serotype 4， FAdV-4）、H9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus of type H9， H9N2-AIV）、禽白血病病毒（Avian leukemia virus， ALV）和传染性贫血病病毒（Chicken anaemia virus， CIAV）。

1.2 试剂和仪器

本研究所用試剂和仪器主要包括：南京诺唯赞生物科技有限公司生产的凝胶回收、质粒提取试剂盒；康为世纪生物科技有限公司生产的病毒核酸提取试剂盒；宝生物工程有限公司生产的Premix Taq（品名：TaKaRa Taq version 2.0 plus dye）DNA 酶、反转录试剂盒、Premix Ex Taq、DH5α、克隆载体pMD 19-T Vector、DNA marker；美国ABI公司生产的QuantStudio Q3 实时荧光定量PCR系统；美国MP公司生产的高速组织破碎仪。

1.3 引物和探针的设计与合成

参考GenBank数据库中的FAdV-4基因序列（登录号：MN102413.1），用BioEdit软件对其进行比对分析，针对Hexon基因序列的保守区，利用Primer Express设计1对qPCR引物与探针序列以及1对标准品引物，同时参照考文献[8]合成1对普通PCR特异性引物，引物序列见表1。本研究所涉及引物和探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 核酸提取及反转录

选取疑似阳性的新鲜临床样品0.2 g加入到2 ml研磨管中，然后加入9倍量的含有4种常用抗生素的PBS（磷酸盐缓冲液），使用匀浆机将样品打碎，10 min，12 000 r/min高速离心后吸取上清液。参照病毒核酸提取试剂盒、反转录试剂盒说明书，进行核酸提取并对其中的RNA病毒核酸进行反转录。提取的核酸和反转录产物低温保存备用。

1.5 重组质粒标准品制备

以提取的FAdV-4核酸为模板进行Hexon基因扩增，回收条带后电泳检测正确的条带。将回收产物与pMD 19-T Vector连接后，转化至感受态细胞，经蓝白斑平板筛选后挑取白斑进行扩增培养并进行菌落PCR鉴定。提取菌液PCR阳性质粒，测定浓度并进行双酶切鉴定，由南京擎科生物科技有限公司对检测合格的质粒进行测序，剩余质粒-80 ℃保存，备用。

1.6 qPCR方法的建立与优化

1.6.1 反应条件优化 进行反应体系与反应条件的系列优化，确定最佳引物浓度、最适退火温度以及最合理的探针浓度。

1.6.2 标准曲线验证 质粒拷贝数=6.02×10²³×质粒质量浓度/（质粒DNA长度×660），重组质粒质量浓度为120 ng/μl，按公式换算可知重组质粒拷贝数为1 μl 3.89×10¹⁰拷贝。首先将重组质粒稀释至1 μl 1×10¹⁰ 拷贝，再按照10倍梯度进行倍比稀释，分别取1 μl 1×10¹⁰ 拷贝至1 μl 10拷贝浓度质粒作为模板，按上述优化的反应条件进行qPCR扩增。最终以质粒拷贝数的对数值为X轴，循环数（Ct值）为Y轴，建立标准曲线^[9]。

1.6.3 特异性验证 分别取NDV、IBV、IBDV、FPV、ILTV、FAdV-4、H9N2-AIV、ALV、CIAV的 DNA 或 cDNA，按照最优反应条件进行qPCR检测，用灭菌超纯水作阴性对照。阳性判定标准为有“S”形扩增曲线且Ct≤35，阴性判定标准为无“S”形扩增曲线且Ct>35，当阴性和阳性对照检测结果均成立时样品结果才有效。

1.6.4 灵敏度验证

1.6.4.1 阳性质粒灵敏度验证 以10倍梯度稀释的阳性质粒（1 μl 1×10¹ ～1×10⁶拷贝）作为模板进行qPCR，确定其检测限，即灵敏度。

1.6.4.2 病料灵敏度 提取阳性新鲜病料的DNA，按已建立的标准曲线进行定量，然后进行10倍梯度倍比稀释，用作模板验证灵敏度。

1.6.5 重复性试验 使用1 μl 1×10⁴ 拷贝、1 μl 1×10⁵ 拷贝、1 μl 1×10⁶ 拷贝 3个浓度的标准质粒来验证重复性。

1.7 临床样品检测

对2020年9月至2022年4月来自江苏盐城、安徽阜阳、江西赣州、广西南宁等地区规模化养鸡场的疑似具有鸡心包积液－肝炎综合征（Hydropericardium hepatitis syndrome， HHS）的病鸡组织样（共计180份）分别应用qPCR方法和普通PCR方法进行检测分析。其中样品采集严格按照2016年修订的兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范（NY/T 541-2016）要求进行^[10]。比较2种方法的阳性率，同时用普通PCR特异性引物对疑似样品进行检测，对扩增产物进行测序分析，比较普通PCR特异性引物与qPCR引物的精确性。

2 结果与分析

2.1 qPCR反应条件的优化

首先将引物和探针均稀释至10 μmol/L，经矩阵法进行系列优化，qPCR的最佳引物浓度为0.3 μmol/L，最佳探针浓度为0.3 μmol/L。最佳反应程序为： 95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s， 60 ℃退火31 s，共计40 个循环。

2.2 标准曲线的绘制

以标准质粒作为模板，浓度为1 μl 1×10¹～1×10¹⁰ 拷贝，按照优化的反应条件进行qPCR，其标准曲线见图1，其线性关系表达式为Y=-3.442x+44.991，R²=0.998，扩增效率（E）=95.226% ，可见该qPCR方法效果良好^[11]，可以用来标定测试品的拷贝数。

2.3 qPCR的特异性验证

应用qPCR方法对NDV、IBV、IBDV、FPV、ILTV、FAdV-4、H9N2-AIV、ALV、CIAV的 DNA 或 cDNA进行检测，结果显示，出现典型“S”形扩增曲线且Ct≤35的病毒仅有FAdV-4（图2），其他病毒均无“S”形扩增曲线，证明此qPCR检测FAdV-4的方法具有特异性。

2.4 qPCR的靈敏度检测

2.4.1 检测标准质粒灵敏度 以浓度为1 μl 1×10¹～1×10⁶拷贝的标准质粒为模板，进行普通PCR检测与qPCR检测。结果发现FAdV-4的普通PCR检测灵敏度为1×10⁴ 拷贝（图3），qPCR检测灵敏度为1×10² 拷贝（图4）。

2.4.2 检测病料灵敏度 将FAdV-4阳性病料的DNA按已建立的标准曲线进行定量，并稀释得到浓度为1 μl 1×10¹～1×10⁶拷贝的病料DNA。结果（图5、图6）显示，普通PCR检测病料灵敏度在1 μl 1×10⁴拷贝，qPCR检测灵敏度为1 μl 1×10²拷贝，qPCR检测灵敏度比普通PCR提升100倍，说明本方法能有效提高临床检测的灵敏度。

2.5 FAdV-4 qPCR的重复性试验

以不同浓度的标准质粒为模板，进行3次平行重复qPCR，该试验重复3个批次，最终验证组内和组间变异系数。结果（表2）显示，组内变异系数最大为0.18%，组间变异系数最大为0.22%，说明该方法重复性良好。

2.6 临床样品检测

应用本研究中建立的qPCR检测方法和普通的PCR方法对临床疑似样品进行检测。结果显示，qPCR的FAdV-4检出率为51.1%（92/180），普通PCR方法的FAdV-4检出率为32.8%（59/180），其中qPCR阳性且普通PCR阳性样品50份，仅qPCR阳性样品42份，仅普通PCR阳性样品9份，具体结果见表3。

对59份普通PCR检测为阳性的病料的扩增产物进行测序分析，同时取仅qPCR阳性的42份样品和10份双阳性样品中的qPCR扩增产物进行测序分析，以确定本研究建立的qPCR方法的准确性，并比较普通PCR引物与本研究设计的qPCR引物的特异性。结果显示，普通PCR的59份扩增产物中51份测序成功，通过BLAST比对分析发现，其中9份扩增片段比目的片段长18 bp，且与GenBank中收录的FAdV-3或FAdV-9序列相似度较高，最高可达98.83%。另外仅qPCR阳性的42份样品BLAST比对分析结果显示，片段大小为667 bp，且与GenBank中收录的FAdV-4毒株相似，相似度高达100.00%。综上可知，普通PCR特异性引物检出符合率为82.35%，而选取的52份qPCR扩增产物测序成功49份，BLAST比对分析结果显示，目的条带大小一致，均为122 bp，且与GenBank中收录的FAdV-4序列相似度达100%。qPCR特异性引物检出的符合率为100.00%。

3 讨论

鸡心包积液-肝炎综合征，又称“安卡拉”病，1986首次暴发于巴基斯坦安卡拉地区^[12]。该病症状典型，流行较快，病原为FAdV-4。相关病例在世界上多个国家相继被报道^[13-14]。2015年以来FAdV感染在国内多个省份的鸡群中暴发，山东省、河南省、江苏省、安徽省等养殖大省无一幸免^[15-16]，极大地增加了中国鸡群的饲养难度。

目前，禽腺病毒不仅多血清型共流行且相对应的诊断方法有限^[17-18]，临床症状还与鸡包涵体肝炎病极为相似，这提高了该病的临床诊断难度。雪上加霜的是禽类感染禽腺病毒后又能继发感染大肠杆菌病、禽流感、传染性法氏囊病等^[19]，此时单凭简单临床诊断手法难以确诊。此外，禽腺病毒不同的血清型的同源性存在差异，相同血清型的不同毒株也存在致病性的不同，阻碍了疫苗研制的步伐，目前中国仅有1种商品化灭活疫苗用于该病的免疫预防^[20]。及时发现并确诊FAdV的感染，准确评估流行趋势，是防范此病流行的最有利措施之一，再加上存在临床症状类似的疾病发生，因此，建立一种高效、灵敏的检测方法显得十分重要^[11]。相较于普通PCR检测特异性差、灵敏度低等问题^[21]，qPCR优势更为突出，定性与定量兼顾且耗时更短，适用于大规模样品检测^[22]。六邻体蛋白（Hexon）是腺病毒最主要的结构蛋白，带有血清型特异性抗原决定簇，学者常以此为靶标设计qPCR检测方法^[23-24]。在已报道的研究中，张云丹等^[9]发现普通PCR检测灵敏度只有约1×10⁵拷贝；刘琳等^[7]开发的FAdV-4的qPCR检测方法，检测限为1 μl 50拷贝，组内和组间重复试验的变异系数分别为0.75%～1.71%和0.60%～1.74%；窦砚国^[25]建立了一种针对FAdV-4的qPCR检测方法，检测灵敏度为20 拷贝，其组内和组间重复试验的变异系数分别为0.12%～0.39%和0.30%～0.60%。本研究中建立的 qPCR检测方法线性关系良好，灵敏度为100 拷贝，组内变异系数均≤0.18%，组间变异系数均≤0.22%，本研究建立的qPCR检测方法的重复性更高。

为了评估该方法，对2020年9月至2022年4月来自江苏盐城、安徽阜阳、江西赣州、广西南宁等地区的疑似感染样品进行检测，结果显示，FAdV-4检出率为51.1%，且抽取测序成功的49份样品测序结果与目的序列一致。上述试验结果证明，该qPCR检测方法比常规PCR具有更强的灵敏度、更高的重复性以及更好的准确性。因此，本研究建立的qPCR检测方法，可作为一种检测和诊断FAdV-4感染的可靠工具，有助于对血清4型禽腺病毒进行临床诊断和防控。

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（责任编辑：陈海霞）