circRNA与膀胱癌关系的研究进展

高梦 荣胜忠 任志颖 苗国庆 李晓霞

[摘要] 环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类具有环形结构的非编码RNA分子，主要存在于真核生物中，内部结构稳定，可经由多种途径发挥作用。膀胱癌（bladder cancer，BC）是目前最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，且近年发病率较高。由于缺乏特异性肿瘤标志物，早期BC往往不能被及时发现，因此对特异性肿瘤标志物进行探索，具有很大的临床意义和价值。circRNA作为研究方向，值得进一步深入，本综述较为系统的介绍了circRNA及其与膀胱癌的关系，并对现有研究的局限性进行了展望。

[关键词] circRNA；生物发生；分子特征；生物学功能；膀胱癌；生物标志物

[中图分类号] R737      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.11.026

膀胱癌（bladder cancer，BC）是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，其发病率在世界排名第9位[1]，目前还没有针对侵入性高级别BC的完美治疗方法。临床主要以手术切除与化疗为主，但BC中晚期时易发生远处转移，耐药严重，且临床效果较差，疗效通常并不理想。由于缺乏特异性的诊断和治疗方法，大多数患者无法在早期被及时发现。因此，探索新的生物标志物和确定膀胱癌的有效治疗靶点至关重要。人类基因组中，非编码RNA占据了真核基因组上总RNA的95%。非编码RNA中主要分为转录的超保守区、微RNA（microRNA，miRNA）、小核仁RNA、与PIWI相互作用RNA、长链非编码RNA和环状RNA（circular RNA，circRNA），circRNA是具有环形结构的非编码RNA分子[2-3]。随着高通量测序技术和基因生信分析的迅速发展，近些年已经成功鉴定了成千上万个circRNAs，证实circRNA具备组织特异性的表达模式。

1  circRNA的生物发生

circRNA源自前体mRNA，具有显著的连续闭环结构，通过自由3′和5′端共价连接，又称为“反向剪接”结构[3]。反向剪接结构的形成不仅需要规范的剪接信号，还需要规范的剪接体机制。多种途径参与circRNA的环化。circRNA一般可分为3种：外显子环状RNA（exonic circRNA，ecircRNA），環状内含子RNA（circular intronic RNA，ciRNA）和外显子–内含子环状RNA（exon-intron circular RNA，EIciRNA）[4]。RNA结合蛋白配对和内含子配对直接驱动环化circRNA形成的反向剪接途径。肌盲蛋白（muscleblind protein，MBL）、Quaking（QKI）和RNA特异性腺苷脱氨酶1（adenosine deaminase acting on RNA 1，ADAR1）等RNA结合蛋白参与调控circRNA的发生。MBL和QKI与侧翼内含子的序列基序结合并将两个侧翼内含子连接在一起，调节相邻的剪接位点以促进circRNA的形成[4]。ADAR1通过与双链RNA结合并融合茎结构来抑制circRNA的形成，从而产生ecircRNA和EIciRNA。关于内含子配对，侧翼内含子中反向重复Alu元件的替代形成及跨侧翼内含子或单个内含子内部的RNA配对之间的竞争都可能引起替代环化，进而引起单个基因产生了多个circRNAs和线性转录本[5]。此外，circRNA可以通过含有外显子的套索驱动途径产生，由外显子跳跃事件形成带有外显子的套索，再通过套索内部剪接去除侧翼内含子序列，最终产生ecircRNA或EIciRNA[6]。ciRNA也是通过套索衍生的机制而形成的，该机制基于一个共识基序，该基序在5'剪接位点附近包含一个7-nt的富Gu元件，在分支点位点附近包含一个11-nt的富C的元件[7]。据报道，古细菌和真核生物中都存在另一种保守的circRNA生物发生模式。在这种情况下，转运核糖核酸（transfer ribonucleic acid，tRNA）剪接核酸内切酶复合物会在凸起–螺旋–凸起基序处切割含内含子的前tRNA，然后将外显子两半连接起来，内含子末端也连接起来形成tRNA内含子环状RNA[8]。当剪接体或转录终止因子在细胞中耗尽时，circRNA成为首选的基因输出，通过抑制或减缓规范的前mRNA加工事件，将蛋白质编码基因的稳态输出传递至环状RNA[9]，为更好地理解circRNA的产生提供了参考。

2  circRNA的特征

circRNA拥有一些共同的特征，主要如下：①广泛的分布和多样性，在植物、动物及所有组织的许多真核生物中，均存在circRNA[10]；②高度的稳定性，由于具有封闭的环形结构特点，circRNA对核糖核酸酶R的降解产生了抗性，且比线性RNA稳定；③特定的表达方式，在不同的发育阶段和不同的细胞与组织中，circRNA有相应的表达；④序列保守性，研究证明，许多circRNA在物种间的进化方面存在序列保守性[10]；⑤正常与病理状态的动态表达谱，研究发现许多circRNA在正常组织和癌症组织之间的表达发生了变化[11]；⑥主要由外显子衍生而来，由单一或多个外显子组成，而且一个最小的外显子长度能形成反向剪切。

3  circRNA的生物学功能

3.1  充当miRNA海绵

miRNA是非编码RNA家族中的一类短的小分子RNA，能够调控转录过后的基因表达水平，特别是在癌症中。circRNA可以作为内源竞争性RNA，通过与miRNA结合并阻止miRNA调节其下游靶基因来影响基因表达。例如，人类小脑变性相关蛋白1反义转录物（cerebellar degeneration related protein 1 antisense，CDR1as/ciRS-7）和小鼠Y染色体性别决定区（sex determining region Y，Sry）是两个最著名的circRNA充当miRNA海绵的示例。CDR1as下调许多癌症相关信号通路中致癌因子的表达，从而通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）途径调节肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭途径[12]。据报道circBIRC6直接与miR-34a和miR-145相互作用调节维持多能性的靶基因，circBIRC6减弱这些靶基因的下调并抑制人类胚胎干细胞的分化[13]。越来越多的circRNA被发现作为miRNA海绵，如circHIPK3能够与9个miRNA结合，还能与miR-124结合并抑制其活性，在癌细胞中产生强增殖作用[14]。由此可见，海绵化miRNA可能是许多circRNA的重要作用机制，circRNA可以海绵化许多不同的miRNA，而并非通过结合某个特定的miRNA的多个位点产生生物抑制或致癌功能。

3.2  与蛋白质相互作用

circRNA还可以与蛋白质相互作用以调节基因表达。MBL是人类盲肌样蛋白1（muscleblind like splicing regulator 1，MBNL1）的同源物，该基因在果蝇和人类体内产生circMbl，其与MBL侧翼内含子拥有传统的肌盲结合位点，从而强力而特异地结合，促进新生RNA环化和circMb1的生物发生，MBL含量的变化强烈影响circMbl的生物合成，这种作用主要依赖于MBL的结合位点[15]。其他circRNA如circPABPN1和circANRIL，也可通过与靶蛋白相互作用来发挥重要作用。circPABPN1与RNA结合蛋白HuR大量结合，使HuR与PABPN1mRNA的结合减少，降低PABPN1的翻译水平，通过与翻译激活因子HuR竞争而降低其可用性，调节PABPN1mRNA的翻译[16]。circANRIL通过与pescadillo核糖体生物发生因子结合，影响了前核糖体RNA的加工和核糖体的生物发生，因此，circANRIL可以诱导核仁应激和p53的激活，随后凋亡增加，增殖率下降，这一途径可以通过在动脉粥样硬化斑块中消除过度增生细胞来促进动脉粥样硬化保护[17]。另外，某些circRNA如circ-Amotl1和circ-Foxo3，可充当蛋白质的支架，促进酶及其底物的共定位。circ-Amotl1能够结合3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（3-phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1）和AKT1，并促进AKT1的PDK1依赖性磷酸化。AKT1随后转移到细胞核，在小鼠模型中显示出心脏保护功能[18]。circ-Foxo3的主要作用之一是促进小鼠的由双微体同源基因2介导的突变p53泛素化，使其靶向蛋白酶体诱导降解[19]。最后，circRNA可能会把某些特定蛋白募集到细胞的特定位置，如circFECR1可把甲基胞嘧啶双加氧酶1募集到其宿主基因FLI1的启动子区域，从而引起CpG位点的去甲基化和转录活性[20]。

3.3  调控转录

circRNA可以顺式或反式影响其亲本基因。ciRNA由脱离分支结构的套索内含子产生，通常积聚在人类细胞的细胞核中，并通过与RNA聚合酶Ⅱ（polymerase Ⅱ，Pol Ⅱ）機制相互作用，使其亲本编码基因的转录得到调节，从而发挥RNA Pol Ⅱ转录的顺式调节作用[7]。同时，EIciRNA能够与U1小核糖核蛋白和Pol Ⅱ相互作用，使亲本基因的转录得到促进[21]。

3.4  翻译

circRNA曾被视为非编码RNA，但最近的研究成果表明了circRNA参与翻译的能力。真核生物核糖体翻译仅需要内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）元件[22]。此外，在人类基因组中已经发现了数千个新的与帽无关的翻译序列，进一步表明circRNA可能是可翻译的[23]。研究显示，circRNA在活体细胞中可通过滚动循环扩增机制高效翻译，产生丰富的蛋白产物[24]。研究人员还发现大量的circRNA能够成为信使RNA，并利用N6-甲基腺苷来编码非帽依赖性翻译机制的蛋白[25]。据报道，circRNA的一个子集与翻译核糖体有关，其通常与宿主RNA共享起始密码子，编码具有特定蛋白质结构域的蛋白质，并以不依赖帽的方式翻译[26]。最近的一项研究也证明，circ-FBXW7能够直接翻译成一个与亲代基因编码的FBXW7蛋白相关联的蛋白，使核蛋白类癌基因c-Myc的稳定性得到调整，进而阻止胶质瘤的发展[27]。

4  circRNA与膀胱癌的关系

研究显示，许多circRNA在BC组织和健康的邻近组织中存在差异表达。circRNA与BC相关的功能有促进肿瘤和抑制肿瘤两种。与健康的邻近组织、正常组织和正常细胞系相比，许多circRNA如circBPTF、circTFRC、circPDSS1、circZFR等在BC组织和细胞系中的表达水平均升高，并在促进肿瘤发展中发挥作用。这些circRNA的高水平与BC的临床病理阶段密切相关，并影响BC的生存。例如，在BC的临床分期中，circPDSS1的表达水平不同，该分期越高，表达水平越高[28]。肿瘤复发是影响预后的一个重要因素，研究发现circBPTF与BC的复发密切相关，复发性肿瘤组织可显示出比原发性肿瘤组织更高的circRNA水平[29]。

4.1  促癌因子

4.1.1  circBPTF  circBPTF在BC组织和细胞系中的表达明显高于非癌组织和细胞系，circBPTF的过度表达与BC患者的不良生存率、较高的肿瘤分期和肿瘤复发相关，表明circBPTF在BC中发挥致癌作用[29]。

4.1.2  circTFRC  circTFRC在BC组织中表达上调，并与患者的肿瘤分级和生存率相关，基因敲除circTFRC可抑制BC细胞体外侵袭、增殖和体内肿瘤生长，circTFRC通过吸收靶向TFRC的miRNA-107上调TFRC的表达，从而促进BC组织中上皮-间质转化、细胞增殖和细胞侵袭[30]。

4.1.3  circPDSS1  circPDSS1在膀胱尿路上皮癌（urothelial bladder cancer，UBC）中表达上调，其表达水平随着临床分期的增加而增加。过表达circPDSS1可导致miR-16的下调，而过表达miR-16对circPDSS1无明显影响，过表达circPDSS1可导致UBC细胞增殖、侵袭和迁移率升高，过表达miR-16不仅能抑制UBC细胞的增殖、侵袭和迁移，还能减弱过表达circPDSS1的作用。因此，circPDSS1可能通过下调miR-16促进UBC的进展[28]。

4.1.4  circZFR  circZFR在BC组织和细胞中的表达高于相邻的非肿瘤组织和正常膀胱上皮细胞。较高的circZFR水平与BC患者的病理T分期、分级、淋巴转移、复发、无进展生存期和总生存期呈正相关，说明circZFR可用作预后的生物标志。circZFR敲低可以显著减弱BC细胞的迁移和侵袭能力，从机制上讲，circZFR可以直接结合miR-377作为海绵，从而促进ZEB2在BC细胞中的表达[31]。

4.1.5  circPRMT5  circPRMT5的高表达与UBC患者的转移和（或）较差的生存水平呈正相关，circPRMT5的上调充当miR-30c的海绵，调节SNAIL1/E-钙黏蛋白途径，通过竞争miR-30c来促进UBC细胞的上皮-间质转化[32]。

4.1.6  circCASC15  circCASC15的表达水平与BC患者的肿瘤分期正相关，主要机制是充当miR-1224-5p海绵来激活致癌的CREB1表达，从而促进BC细胞的增殖[33]。

4.1.7  circRGNEF  circRGNEF高表达预示了BC预后不良，其与淋巴结转移、高病理性T期和高分期相关，与低circRGNEF表达的患者相比，circRGNEF高表达与较差的总体生存率相关[34]。

4.1.8  circRIP2  研究发现，circRIP2能够上调BC组织中TGF-β2的表达，并通过TGF-β2/Smad3蛋白途径诱导上皮内皮细胞转移，有效的circRIP2活性通过激活miR-1305/转化生长因子β2/Smad3通路而诱导BC的发生发展，从而加速膀胱癌的进展[35]。

4.2  抑癌因子

4.2.1  Cdr1as  作为第1个被发现具有miRNA海绵作用的circRNA，Cdr1as在BC组织中的表达明显低于邻近的正常组织。Cdr1as表达上调，在体外能抑制BC细胞的生长、侵袭和迁移，在体内能抑制肿瘤的生长。Cdr1as能使BC中的多个miRNA發生海绵化，并通过与miR-135a结合来控制BC细胞的生长、浸润和迁移，进而起到抗肿瘤效果[36]。

4.2.2  circHIPK3  又称为膀胱癌相关的环形RNA-2，在BC中表达下调，与肿瘤分级、侵袭程度及淋巴结转移呈相反的变化，circHIPK3通过靶向miR-558抑制乙酰肝素酶的表达，从而抑制BC细胞的侵袭和转移[37]。

4.2.3  circFNDC3B  在人类BC组织中，circFNDC3B的表达明显减少，并且与病理T分期、分级、淋巴侵犯程度以及患者的总存活率密切相关。在体外和体内，过表达的circFNDC3B在功能方面都明显抑制了细胞的生长、迁移和侵袭。circFNDC3B作为miR-1178-3p海绵，抑制癌基因G3BP应激颗粒组装因子2，从而抑制与G3BP2基因相对应的SRC/FAK信号通路，circFNDC3B的过表达可以通过靶向miR-1178-3p/G3BP2/SRC/FAK轴来有效控制体外细胞生长和侵袭，并在体内控制癌细胞增殖和淋巴结转移，表明circFNDC3B可成为一个全新的癌症抑制因子和药物靶点[38]。

4.2.4  circITCH  circITCH在BC组织中表现下调，circ-ITCH低表达的BC患者生存期减少。circITCH的强制表达可抑制细胞在体内外的生长、迁移、侵袭和转移。circITCH通过作为miR-17和miR-224的分子海绵，使miR-17的靶基因p21表现上调，miR-224靶基因PTEN的表现上调，进而抑制BC的侵袭性生物学行为[39]。

4.2.5  circLPAR1  circLPAR1在MIBC组织中表达下调。相比于表达上调患者，circLPAR1表达下调的患者特异性生存期更短。circLPAR1可以与miR-762结合并抑制其作为miRNA海绵的活性，即circLPAR1在miR-762的侵袭和转移中起关键作用[40]。

5  小結与展望

circRNA是BC进程中的重要因素，circRNA为BC的诊断、预后和治疗提供了新的视角。多种circRNAs在BC组织中有差异表达，且其功能失调程度与BC患者的临床病理特征直接相关。circRNA具有高度稳定性、高丰度及在不同体液中的广泛分布的特点，既是有前景的治疗和预后生物标志，也是BC的潜在治疗靶标。尽管在circRNA研究领域已取得了许多进步，但仍有许多局限性。首先，circRNA的生物发生、更新、作用机制和功能尚不清楚，与功能未知的大量circRNA相比，仅验证了少数circRNA的功能。其次，circRNA在组织细胞中的特异性表达是怎样被调控的，目前还不明确，需要进一步的验证。最后，大多数研究的样本量很小，通常缺乏不同组织学等级和病理学阶段的表达谱，而且统一规范的circRNA命名系统也应该尽快被建立起来。

综上所述，由于circRNA的产生过程和功能更加丰富了真核生物转录组的复杂性与多样性，充实了后基因组时代的研究内容，因此，对这类非编码RNA的研究具有潜在的治疗和研究应用价值，但circRNA领域的研究仍处于起步阶段，今后仍需做大量的研究。

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