垂体腺瘤患者Delta 样蛋白1 同源物、母系表达基因3、母系表达基因8 基因表达水平及其临床意义研究

吴炜，刘永亮，王彦，董晓柳，张利，马思伟，张欢，高华，董伟

垂体腺瘤是起源于鞍内垂体前叶的肿瘤，是最常见的颅内肿瘤之一，根据临床症状可分为功能性腺瘤和无功能腺瘤［1］，其中功能性腺瘤又可分为生长激素（growth hormone，GH）腺瘤、泌乳素瘤、促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）腺瘤。《2022年世界卫生组织垂体腺瘤/垂体神经内分泌肿瘤分类概述》［2］提出了细胞谱系概念，认为垂体腺瘤主要分为PIT1谱系、类固醇激素因子1（steroidogenic factor 1，SF-1）谱系和T盒转录因子19（T-box transcription factor 19，TPIT）谱系。除PIT1起源的泌乳素瘤外，其他功能性腺瘤（GH腺瘤和ACTH腺瘤）的药物治疗效果不佳，因此探讨垂体腺瘤的发生发展机制，对其临床治疗具有重要意义［3］。

Delta样蛋白1同源物（Delta like non-canonical Notch ligand 1，DLK1）/母系表达基因（maternally expressed gene，MEG）3基因座位于14号染色体32.2区域，其包含3个蛋白编码基因（即DLK1、反转录转座子1、脱碘酶3基因）和大量母系表达的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）（包括lncRNA MEG3和超过50个miRNA的集群）［4］。文献报道，DLK1/MEG3基因座在细胞分化和组织发育中发挥着重要作用，其可参与机体多种病理生理学过程［5］。研究显示，与野生型小鼠相比，过表达DLK1的转基因小鼠垂体GH分泌增加、胰岛素抵抗者占比升高；此外，过表达DLK1基本不影响垂体泌乳素和ACTH的分泌［6］。MEG3和MEG8在不同亚型垂体腺瘤中呈差异表达，二者均具有抑制肿瘤生长的作用［7-8］。本研究旨在分析垂体腺瘤患者DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平及其临床意义，以期为垂体腺瘤患者的临床诊疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2015年6月至2019年12月于唐山市人民医院行手术切除的垂体腺瘤患者92例为研究对象。纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）伴有头痛、视力下降、视野缺损等垂体腺瘤的典型临床症状，MRI检查显示T1WI和T2WI低信号，强化明显，经病理检查诊断为垂体腺瘤；（3）原发性肿瘤。排除标准：（1）合并其他肿瘤者；（2）合并严重的呼吸、循环系统疾病者；（3）合并其他类型代谢疾病者；（4）合并认知障碍或精神类疾病者；（5）入院1个月内参与其他临床试验者。本研究获得唐山市人民医院伦理委员会批准（审批号：RMYY-LLKS-2020-013），所有患者或家属签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料收集 收集患者一般资料，包括性别、年龄、肿瘤体积、肿瘤增殖状态（Ki67指数≥3%为高增殖，＜3%为低增殖）、肿瘤侵袭性（Knosp分级Ⅲ～Ⅳ级为侵袭性生长，Knosp分级Ⅰ～Ⅱ级为非侵袭性生长）、病理类型（分为GH腺瘤和无功能腺瘤）。

1.2.2 RT-qPCR法检测肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8、POU类1同源框1（POU class 1 homeobox 1，POU1F1）、类固醇生成因子1（steroidogenic factor 1，SF-1）基因表达水平 RNA抽提试剂盒购自凯杰企业管理（上海）有限公司，反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific。取10 mg左右肿瘤组织标本，利用一步法提取细胞总RNA，反转录合成cDNA；以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR。PCR扩增条件为：50 ℃ 20 min，95 ℃ 10 min、95 ℃10 s、60 ℃ 1 min，共40个循环。引物由北京合生基因科技有限公司合成，引物序列如下：DLK1正向引物为5′-ACGAGTGCTGTACATGACCA-3′，反向引物为5′-GGCTCTCTCTGACTGACACA-3′；MEG3正向引物为5′-TCTTCAAGGAGGTCACGGAC-3′，反向引物为5′-GGACACATCAAATCGCTGCT-3′；MEG8正向引物为5′- GGGCCCTGTTAGTCTGACTT-3′，反向引物为5′-CAAAGTCAGACCCAGGCAAC-3′；POU1F1正向引物为5′-TCCTGACCACACCTTGAGTC-3′，反向引物为5′-GCCTCCCCAACATTTGTCTG-3′；SF-1正向引物为5′- TCTGAGTACCCGGAGCCTTA-3′，反向引物为5′-TGGAGATGAAGGTCTGGTCG-3′；内参GAPDH正向引物为5′-CCAAGGAGTAAGACCCCTGG-3′，反向引物为5′-TGGTTGAGCACAGGGTACTT-3′。采用2-ΔΔCt法计算目标基因表达水平。

1.2.3 免疫组织化学染色检测肿瘤组织GH、PIT1、SF-1表达情况 采用10%中性甲醛固定肿瘤组织，进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋、连续切片（5 μm），将切片置于60 ℃的烤箱烤1 h，梯度脱蜡，抗原修复后采用羊血清封闭30 min，滴加GH、PIT1、SF-1一抗（购自英国Abcam公司），4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，加入二抗（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）室温孵育1 h，PBS洗3次，采用DAB显色试剂盒（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）显色后用自来水冲洗，进行苏木素复染、梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，于显微镜下观察染色情况，以细胞内出现棕色和棕褐色染色颗粒为阳性。随机挑选5个高倍（×400）视野，统计阳性细胞数量和细胞总数。结果判断标准：（1）阴性：阳性细胞占比≤1%；（2）弱阳性：1%＜阳性细胞占比≤5%；（3）阳性：阳性细胞占比＞5%。

1.2.4 ELISA检测血清GH、胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor 1，IGF-1）水平 采集患者空腹静脉血0.5 ml，3 000 r/min离心5 min（离心半径13.5 cm），采用移液器取10 μl血清，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测GH、IGF-1水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用非参数检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验，单向有序分类指标比较采用秩和检验；两变量间的相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 92例垂体腺瘤患者中，男63例，女29例；年龄21～75岁，平均（50.7±1.2）岁；肿瘤体积0.04～155.30 cm3，平均（10.80±2.20）cm3；肿瘤高增殖28例，肿瘤低增殖64例；肿瘤侵袭性生长32例，肿瘤非侵袭性生长60例；病理类型：GH腺瘤28例，无功能腺瘤64例；肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8、POU1F1、SF-1基因表达水平分别为（0.077±0.015）、（0.066±0.017）、（0.010±0.002）、（0.331±0.060）、（0.125±0.014）；肿瘤组织GH表达情况：阳性25例，弱阳性3例，阴性64例；肿瘤组织PIT1表达情况：阳性27例，弱阳性20例，阴性45例；肿瘤组织SF-1表达情况：阳性63例，弱阳性14例，阴性15例；血清GH水平为（5.0±1.1）ng/ml；血清IGF-1水平为（266.5±31.1）ng/ml。

2.2 GH腺瘤与无功能腺瘤患者一般资料比较 GH腺瘤患者男性占比、年龄低于无功能腺瘤患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；GH腺瘤与无功能腺瘤患者肿瘤体积、肿瘤高增殖者占比、肿瘤侵袭性生长者占比比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 GH腺瘤与无功能腺瘤患者一般资料比较Table 1 Comparison of general information between patients with GH adenomas and non-functioning adenoma

2.3 不同临床特征垂体腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平比较 男性垂体腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG8基因表达水平低于女性垂体腺瘤患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；男性与女性垂体腺瘤患者肿瘤组织MEG3基因表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。年龄≤52岁垂体腺瘤患者肿瘤组织DLK1基因表达水平高于年龄＞52岁垂体腺瘤患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；年龄≤52岁与年龄＞52岁垂体腺瘤患者肿瘤组织MEG3、MEG8基因表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。不同肿瘤体积、肿瘤增殖状态、肿瘤侵袭性垂体腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。GH腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平高于无功能腺瘤患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不同临床特征垂体腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平比较Table 2 Comparison of expression levels of DLK1，MEG3，and MEG8 gene in tumor tissues of patients with pituitary adenomas of different clinical characteristics

2.4 垂体腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平与肿瘤组织POU1F1、SF-1基因表达水平的相关性 Pearson相关分析结果显示，垂体腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平与肿瘤组织POU1F1基因表达水平均呈正相关，与肿瘤组织SF-1基因表达水平均呈负相关（P＜0.05），见表3。

表3 垂体腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平与肿瘤组织POU1F1、SF-1基因表达水平的相关性Table 3 Correlation between expression levels of DLK1，MEG3，and MEG8 gene in tumor tissue of pituitary adenoma patients and expression levels of POU1F1 and SF-1 gene in tumor tissue

2.5 不同肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平垂体腺瘤患者肿瘤组织GH、PIT1、SF-1表达情况比较 根据肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平的中位数，分别将患者分为DLK1基因高表达组（DLK1基因表达水平≥0.000 15，46例）和DLK1基因低表达组（DLK1基因表达水平＜0.000 15，46例）、MEG3基因高表达组（MEG3基因表达水平≥0.000 11，46例）和MEG3基因低表达组（MEG3基因表达水平＜0.000 11，46例）、MEG8基因高表达组（MEG8基因表达水平≥0.000 08，46例）和MEG8基因低表达组（MEG8基因表达水平＜0.000 08，46例）。DLK1基因高表达组与DLK1基因低表达组、MEG3基因高表达组与MEG3基因低表达组、MEG8基因高表达组与MEG8基因低表达组肿瘤组织GH、PIT1、SF-1表达情况比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。DLK1基因低表达组肿瘤组织GH、PIT1阳性者占比及SF-1弱阳性、阴性者占比低于DLK1基因高表达组，GH、PIT1阴性者占比及SF-1阳性者占比高于DLK1基因高表达组，差异有统计学意义（P＜0.05）；MEG3基因低表达组肿瘤组织GH、PIT1阳性者占比及SF-1弱阳性、阴性者占比低于MEG3基因高表达组，GH、PIT1阴性者占比及SF-1阳性者占比高于MEG3基因高表达组，差异有统计学意义（P＜0.05）；MEG8基因低表达组肿瘤组织GH、PIT1阳性者占比及SF-1弱阳性、阴性者占比低于MEG8基因高表达组，GH、PIT1阴性者占比及SF-1阳性者占比高于MEG8基因高表达组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4～6。

表4 DLK1基因高表达组与DLK1基因低表达组肿瘤组织GH、PIT1、SF-1表达情况比较〔n（%）〕Table 4 Comparison of GH，PIT1，and SF-1 expression in tumor tissues between DLK1 gene high expression group and DLK1 gene low expression group

表5 MEG3基因高表达组与MEG3基因低表达组肿瘤组织GH、PIT1、SF-1表达情况比较〔n（%）〕Table 5 Comparison of GH，PIT1，and SF-1 expression in tumor tissues between MEG3 gene high expression group and MEG3 gene low expression group

表6 MEG8基因高表达组与MEG8基因低表达组肿瘤组织GH、PIT1、SF-1表达情况比较〔n（%）〕Table 6 Comparison of GH，PIT1，and SF-1 expression in tumor tissues between MEG8 gene high expression group and MEG8 gene low expression group

2.6 GH腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平与血清GH、IGF-1水平的相关性 GH腺瘤患者血清GH、IGF-1水平分别为（4.4±1.0）ng/ml、（401.0±45.6）ng/ml。Pearson相关分析结果显示，GH腺瘤患者肿瘤组织DLK1基因表达水平与血清GH水平呈正相关（P＜0.05），与血清IGF-1水平无直线相关关系（P＞0.05）；GH腺瘤患者肿瘤组织MEG3、MEG8基因表达水平与血清GH、IGF-1水平均无直线相关关系（P＞0.05），见表7。

表7 GH腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平与血清GH、IGF-1水平的相关性Table 7 Correlation between the expression levels of DLK1，MEG3，MEG8 gene in tumor tissue and serum GH and IGF-1 levels in patients with GH adenoma

3 讨论

基因组印迹指根据亲本来源进行单等位基因表达的表观遗传现象，与早期胚胎发育、癌变和肿瘤易感性密切相关，是目前肿瘤研究的热点之一［9］。在不同病理类型垂体腺瘤中，DLK1/MEG3基因座呈差异表达，且DLK1水平与GH水平有关［5］。在无功能腺瘤中，MEG3通过诱导细胞凋亡而发挥抑制肿瘤细胞增殖和侵袭的作用［10］。本研究旨在分析垂体腺瘤患者DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平及其临床意义。

本研究结果显示，92 例垂体腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8 基因表达水平分别为（0.077±0.015）、（0.066±0.017）、（0.010±0.002），均低于正常人群［11］。本研究结果还显示，男性垂体腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG8基因表达水平低于女性垂体腺瘤患者，提示DLK1、MEG8水平升高可能参与女性垂体腺瘤的发生。年龄≤52岁垂体腺瘤患者肿瘤组织DLK1基因表达水平高于年龄＞52岁垂体腺瘤患者，提示DLK1基因表达水平可能与年龄有关，其在高龄患者中降低。不同肿瘤体积、肿瘤增殖状态、肿瘤侵袭性垂体腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平比较，差异无统计学意义，提示DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平可能与肿瘤体积、增殖状态和侵袭性无关。

《2022年世界卫生组织垂体腺瘤/垂体神经内分泌肿瘤分类概述》［2］提出了细胞谱系概念，将垂体腺瘤定义为垂体神经内分泌肿瘤，指出其主要表现为垂体的良性增生，并根据转录因子水平将其重新分为三类七型。据报道，PIT1可促进垂体细胞向泌乳素细胞、GH细胞和促甲状腺素细胞分化，而SF-1可促进垂体细胞向促性腺激素细胞分化，并与促性腺激素细胞腺瘤有关［2，12］。本研究结果显示，垂体腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平与肿瘤组织POU1F1基因表达水平均呈正相关，与肿瘤组织SF-1基因表达水平均呈负相关；DLK1基因低表达组肿瘤组织PIT1阳性者占比及SF-1弱阳性、阴性者占比低于DLK1基因高表达组，PIT1阴性者占比及SF-1阳性者占比高于DLK1基因高表达组；MEG3基因低表达组肿瘤组织PIT1阳性者占比及SF-1弱阳性、阴性者占比低于MEG3基因高表达组，PIT1阴性者占比及SF-1阳性者占比高于MEG3基因高表达组；MEG8基因低表达组肿瘤组织PIT1阳性者占比及SF-1弱阳性、阴性者占比低于MEG8基因高表达组，PIT1阴性者占比及SF-1阳性者占比高于MEG8基因高表达组；提示DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平与垂体腺瘤转录因子的表达有关，即随着DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平的增加，转录因子POU1FA表达水平升高，SF-1表达水平降低。本研究结果还显示，GH腺瘤患者肿瘤组织DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平高于无功能腺瘤患者，笔者推测DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平升高可促进垂体腺瘤细胞向PIT1谱系分化，临床表现为GH腺瘤表型；其降低可促进垂体腺瘤细胞向SF-1谱系分化，临床表现为无功能腺瘤表型。但本研究结果还显示，GH腺瘤患者男性占比、年龄低于无功能腺瘤患者，这可能对本研究结果产生一定影响，尚需要大样本量的研究进一步证实。

2021年2月《垂体协会肢端肥大症诊治指南》［13］更新版发布，其明确指出术后动态监测GH、IGF-1水平有助于了解疾病进展情况［14］。且研究显示，GH-IGF轴中的GH与DLK1存在共定位［15］。本研究结果显示，DLK1基因低表达组、MEG3基因低表达组、MEG8基因低表达组肿瘤组织GH阳性者占比分别低于DLK1基因高表达组、MEG3基因高表达组、MEG8基因高表达组，GH阴性者占比分别高于DLK1基因高表达组、MEG3基因高表达组、MEG8基因高表达组，提示DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平升高可能促进垂体腺瘤肿瘤细胞中GH的合成。本研究Pearson相关分析结果显示，GH腺瘤患者肿瘤组织DLK1基因表达水平与血清GH水平呈正相关，与既往研究结果［5］一致；GH腺瘤患者肿瘤组织DLK1基因表达水平与血清IGF-1水平无直线相关关系，GH腺瘤患者肿瘤组织MEG3、MEG8基因表达水平与血清GH、IGF-1水平均无直线相关关系，提示DLK1/MEG3基因座中的DLK1基因是调控GH分泌的关键基因，而MEG3、MEG8基因与GH分泌无关，且三者均对来源于肝脏的IGF-1释放没有影响，推测DLK1可能作为GH腺瘤患者的治疗靶点，这对丰富GH腺瘤患者的治疗选择具有积极意义。

综上所述，垂体腺瘤患者的DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平低于正常人群。DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平升高可促进垂体腺瘤细胞向PIT1谱系分化，临床表现为GH腺瘤表型；其降低可促进垂体腺瘤细胞向SF-1谱系分化，临床表现为无功能腺瘤表型。DLK1基因是调控GH分泌的关键基因，其可能作为GH腺瘤患者的治疗靶点。由于泌乳素瘤患者常规选择药物治疗且效果较好，ACTH腺瘤为罕见病，临床收集这两类垂体腺瘤的标本非常困难，本研究并未分析泌乳素瘤、ACTH腺瘤患者DLK1、MEG3、MEG8基因表达水平，且本研究样本量较小，因而本研究结论尚需要大样本量的研究进一步证实。

作者贡献：吴炜进行文章的构思与设计，撰写论文；高华进行研究的实施与可行性分析、文章的质量控制及审校；刘永亮、王彦、张欢进行数据收集；张利进行数据整理；董晓柳进行统计学处理；马思伟负责结果的分析与解释；吴炜、高华、董伟进行论文的修订；董伟对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。