不同剂量维生素D3 对腹主动脉压力过负荷大鼠心脏结构、功能的影响

王婷，付建莉，张雪梅，赵媛，赵玉兰

现有证据表明，射血分数降低的心力衰竭（heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF）患者25羟维生素D〔25-hydroxyvitamin D，25（OH）D〕水平低于健康对照者［1］，且低水平维生素D是HFrEF患者死亡的独立预测因子［2］。但心力衰竭患者补充维生素D的临床效果却大相径庭。临床研究表明，补充维生素D可以改善慢性心力衰竭患者的左心室功能，延缓左心室重塑［3］。但另外一项随访3年的临床试验结果显示，补充维生素D并不能降低HFrEF患者的全因死亡率，反而会增加其心脏支架置入风险［4］。笔者所在课题组进行的系统评价结果显示，维生素D未能改善HFrEF患者的心功能及降低其死亡率，分析原因可能与维生素D服用剂量不足/过量、合并用药导致机体的25（OH）D及血钙浓度不适宜有关［5］。为了减少生活习惯、合并疾病、口服药物等因素的影响，最大限度地了解不同剂量维生素D对心脏结构、功能的影响，本实验通过分析不同剂量维生素D3对腹主动脉压力过负荷大鼠心脏结构、功能的影响，探讨维生素D3-25（OH）D-心脏结局之间的量效关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验时间 本实验时间为2021年6月。

1.2 实验动物及分组 选取健康雄性Wistar大鼠60只，8～10周龄，体质量160～200 g，购自西安交通大学实验动物中心，并通过西安交通大学医学部动物实验伦理审查，适应性喂养3 d。采用随机数字表法将大鼠分为安慰剂组（A组）、小剂量组（B组）、中等剂量组（C组）、大剂量组（D组），每组15只。四组大鼠均采用腹主动脉缩窄术制备腹主动脉压力过负荷模型，具体如下：采用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射以麻醉大鼠，采用电热毯保暖，在大鼠左上腹做一切口，充分暴露腹主动脉，在双肾动脉上方0.5 cm处将8号针头与腹主动脉共同结扎，拔出针头，造成腹主动脉管腔环形缩窄50%～60%。术后每天肌肉注射青霉素10万U，连续注射3 d。术后按照Sharma方法进行换算［6］，四组大鼠分别给予安慰剂、小剂量维生素D3（84 U/kg）、中等剂量维生素D3（420 U/kg）、大剂量维生素D3（2 100 U/kg）进行灌胃。灌胃方法：将400 U维生素D3置于1 ml花生油中进行稀释，按照大鼠分组情况抽取含有相应剂量维生素D3的花生油，再抽取纯花生油至2 ml，进行灌胃，1次/d，连续灌胃8周。

1.3 观察指标

1.3.1 一般情况 观察四组大鼠进食及活动耐量情况。

1.3.2 超声心动图检查指标 灌胃8周后，所有大鼠进行超声心动图检查，所用仪器为飞利浦Epiq7C超声诊断仪。取胸骨旁左心室长轴切面，将取样线置于乳头肌水平，探头频率为5.0～11.5 MHz。经左心室长轴获得标准二维图像后改为M型模式，然后测量室间隔厚度（interventricular septal thickness，IVST）、左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）、左心室收缩末期内径（left ventricular endsystolic diameter，LVESD）、左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）和左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。以上指标均连续测量3个心动周期并取平均值。

1.3.3 实验室检查指标 灌胃8周后，四组大鼠均禁食不禁水10 h，于尾静脉取血，采用邻甲酚酞络合铜法测定血清钙水平，采用磷钼酸盐法测定血清磷水平，所用仪器为全自动生化分析仪（美国贝克曼公司）；采用电化学免疫发光法测定血清25（OH）D水平，所用仪器为COBAS e601电发光免疫分析仪（瑞士罗氏公司）；采用酶联免疫吸附试验测定血清N末端脑钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验（方差齐）或Dunnett's T3检验（方差不齐）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 术中及术后共7只大鼠死亡，其中A组死亡2只、B组死亡2只、C组死亡1只、D组死亡2只。四组大鼠进食及活动耐量均无明显差异。

2.2 超声心动图检查指标 灌胃8周后，四组大鼠IVST、LVPWT、LVESD、LVEDD、LVEF比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组大鼠IVST、LVPWT、LVESD、LVEDD小于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）；C组大鼠IVST和LVEDD大于B组，LVPWT、LVESD、LVEDD小于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）；D组大鼠IVST、LVPWT、LVESD、LVEDD大于A、B、C组，LVEF低于B、C组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。灌胃8周后，四组大鼠LVEF均＜50%，提示四组大鼠符合HFrEF的LVEF改变。

表1 四组大鼠灌胃8周后超声心动图检查指标比较（±s）Table 1 Comparison of echocardiographic examination indicators in four groups after 8 weeks of gavage

表1 四组大鼠灌胃8周后超声心动图检查指标比较（±s）Table 1 Comparison of echocardiographic examination indicators in four groups after 8 weeks of gavage

注：A组为安慰剂组，B组为小剂量组，C组为中等剂量组，D组为大剂量组；IVST=室间隔厚度，LVPWT=左心室后壁厚度，LVESD=左心室收缩末期内径，LVEDD=左心室舒张末期内径，LVEF=左心室射血分数；a表示与A组比较，P＜0.05；b表示与B组比较，P＜0.05；c表示与C组比较，P＜0.05

LVEF（%）A组133.34±0.06 3.15±0.07 5.81±0.10 7.16±0.1038.8±2.9 B组133.20±0.08a 2.94±0.10a 5.57±0.11a 6.97±0.12a40.7±3.2 C组143.29±0.08b 3.01±0.12a 5.66±0.09a 7.06±0.12ab 40.8±2.1 D组13 3.45±0.12abc 3.25±0.08abc 5.91±0.11abc 7.26±0.07abc 36.4±2.9bc F值18.3321.7024.8117.326.69 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01组别 只数IVST（mm）LVPWT（mm）LVESD（mm）LVEDD（mm）

2.3 实验室检查指标 灌胃8周后，四组大鼠血清磷水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；四组大鼠血清钙、25（OH）D、NT-proBNP水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。灌胃8周后，B、C、D组大鼠血清钙、25（OH）D水平高于A组，C、D组大鼠血清钙、25（OH）D水平高于B组，D组大鼠血清钙、25（OH）D水平高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）。灌胃8周后，B、C组大鼠血清NT-proBNP水平低于A、D组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 四组大鼠灌胃8周后实验室检查指标比较（±s）Table 2 Comparison of laboratory examination indexes in four groups after 8 weeks of gavage

表2 四组大鼠灌胃8周后实验室检查指标比较（±s）Table 2 Comparison of laboratory examination indexes in four groups after 8 weeks of gavage

注：25（OH）D=25羟维生素D，NT-proBNP=N末端脑钠肽前体；a表示与A组比较，P＜0.05；b表示与B组比较，P＜0.05；c表示与C组比较，P＜0.05

组别只数钙（mmol/L） 磷（mmol/L） 25（OH）D（nmol/L） NT-proBNP（ng/L）A组 133.94±0.123.04±0.1226.58±7.38711.00±97.42 B组 13 3.95±1.29a2.99±0.1756.54±7.31a583.92±65.40a C组 14 4.06±0.09ab3.01±0.17160.17±11.57ab564.08±56.01a D组 13 4.27±0.15abc 3.04±0.13505.73±18.56abc771.27±83.50bc F值17.631.404 424.3819.81 P值＜0.010.25＜0.01＜0.01

3 讨论

现有证据表明，低水平维生素D可能通过多种途径引起HFrEF患者心肌重塑、炎症反应及心功能恶化，如低水平维生素D可刺激肾素表达，激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统［7］；其还会继发甲状旁腺功能亢进，而甲状旁腺功能亢进是心力衰竭患者心血管事件及全因死亡风险增加的独立危险因素［8］；此外，维生素D还会通过下调核因子κB表达而抑制促炎因子的表达，进而抑制IL-6、IL-12、干扰素、肿瘤坏死因子的表达［9］。动物实验结果显示，1，25-二羟基维生素D（维生素D的活性形式）可有效下调肾素的表达［10］。此外，在维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）缺失的小鼠或维生素D缺乏的大鼠体内肾素表达水平明显升高，且其与高血压、心肌肥厚和心力衰竭的发生有关［10-11］。研究表明，低水平25（OH）D与心血管疾病发生风险升高相关［12］。但也有研究显示，25（OH）D水平与心血管事件发生率呈U型曲线关系，即25（OH）D过低或过高均会导致心血管事件的发生［13］。

《维生素D及其类似物临床应用共识》［14］指出，对于维生素D缺乏高风险人群，其维生素D最高耐受剂量为10 000 U/d。本研究为了分析维生素D3-25（OH）D-心脏结局之间的量效关系，选择了剂量范围较大的维生素D3（其中B、C、D组维生素D3补充剂量约等同于人维生素D3剂量的800 U/d、4 000 U/d、20 000 U/d），结果显示，灌胃8周后，B组大鼠IVST、LVPWT、LVESD、LVEDD小于A组；C组大鼠IVST和LVEDD大于B组，LVPWT、LVESD、LVEDD小于A组；D组大鼠IVST、LVPWT、LVESD、LVEDD大于A、B、C组，LVEF低于B、C组；B、C组大鼠LVEF与A组比较无统计学差异，但其血清NT-proBNP水平低于A、D组。上述研究结果提示维生素D3与左心室功能、结构改变呈U型曲线关系。《维生素D及其类似物临床应用共识》［14］推荐，维持骨骼健康的循环25（OH）D水平应为75 nmol/L（30 μg/L）。ZHOU等［15］研究指出，人们的最初心血管疾病风险是随着25（OH）D水平升高而急剧下降的，并稳定在50 nmol/L左右。本研究结果显示，B组大鼠平均25（OH）D水平为56.54 nmol/L，高于A组，该组大鼠心脏结构和功能明显改善；C组大鼠平均25（OH）D水平为160.17 nmol/L，高于B组，但该组大鼠较B组心脏结构和功能改善并不明显；D组大鼠平均25（OH）D水平为505.73 nmol/L，高于A、B、C组，但该组大鼠心脏结构及功能反而出现了恶化表现。

综上所述，维生素D3补充剂量与腹主动脉压力过负荷大鼠心脏结构、功能改变呈U型曲线关系，即补充小剂量维生素D3能减轻压力过负荷大鼠心脏结构、功能恶化，而补充大剂量维生素D3反而促进了腹主动脉压力过负荷大鼠心脏结构、功能的恶化。该研究提示在临床工作中，应定期监测患者25（OH）D及血钙水平，既要保证患者维生素D水平达标，也应避免过量补充维生素D。但本研究观察时间较短，且未细化维生素D的补充剂量，尚不能明确导致心脏出现不良反应的25（OH）D水平截点。

作者贡献：王婷、赵玉兰进行文章的构思与设计；王婷、付建莉、张雪梅进行研究的实施与可行性分析；付建莉、张雪梅、赵媛进行数据收集、整理、分析；王婷、张雪梅进行结果分析与解释；王婷负责撰写、修订论文；张雪梅负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。