环状核糖核酸与肾小球疾病

雷 静 刘 颖 何 平 刘大军

环状核糖核酸(circRNA)是一种内源性非编码RNA,其3’和5’端共价闭合组成连续的环状结构[1]。circRNA通过外显子、内含子及转运RNA(transfer RNA,t-RNA)等从头到尾剪接形成,广泛存在于真核细胞中,其具有许多微RNA(microRNA,miRNA)结合位点,可作为分子“海绵”吸附miRNA以发挥作用。例如,小脑变性相关蛋白1反义转录物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense transcript,CDR1as)含有超过70个miRNA-7的结合位点,通过与miRNA-7结合,可以显著降低miRNA-7的活性[2]。除了作为miRNA的“海绵”以外,circRNA还可通过miRNA应答元件(miRNA response element,MRE)与miRNA结合,影响miRNA介导的靶基因在转录后水平沉默,调节mRNA的表达进而调控功能蛋白质的翻译,因此也被称为竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)。ceRNA参与许多肾脏疾病的发生、发展,如急性肾损伤、狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)等[3]。此外,circRNA也可作为RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ,PolⅡ)转录的正调控因子,促进基因的表达。因此,circRNA作为转录及转录后调节因子,在细胞中可刺激或抑制内源性miRNA的表达。另外,circRNA作为单链RNA,还可以与目标RNA的3’-非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)结合以调节其表达,以及参与较大的RNA或蛋白复合物的组装[4-6]。一些circRNA还可作为信使RNA(mRNA)指导蛋白质的翻译[7]。因此,circRNA对miRNA相关性疾病具有调控作用。

目前,临床上对于肾小球疾病的诊断主要依靠肾穿刺活组织检查(活检),然而肾活检为侵入性检查,风险大,易出血,而且难以多次重复检查。随着二代测序等技术的发展,越来越多的研究报道,circRNA参与IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)、特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)、局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)、LN和糖尿病肾病(diabetic nephropahy,DN)等肾小球疾病的发生、发展,或可提供潜在的诊断标志物及治疗靶点。因此,从circRNA的角度研究肾小球疾病的发病机制及治疗方案具有重要意义。

1 circRNA与原发性肾小球疾病

1.1 circRNA与IgAN IgAN是一种常见的免疫复合物介导的肾小球肾炎,约占肾小球疾病中的40%[8]。IgAN的病理机制主要为去糖基化IgA1(galactose-deficient IgA1,Gd-IgA1)的异常合成,Gd-IgA1可单独或形成免疫复合物沉积在肾脏系膜区,造成系膜细胞的增生和间质沉积,导致肾脏纤维化[9]。有研究[3]筛选出IgAN患者与健康对照者血清中差异表达的circRNA、miRNA和mRNA,并构建了circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络,经生物信息学分析发现,相关基因通过参与含氮化合物代谢过程、cAMP反应元件蛋白结合过程,以及乙型肝炎、朊病毒和人T细胞白血病病毒1感染等过程参与IgAN的疾病进展,其中hsa_circ_04621表达下调,涉及NOD样受体信号通路;hsa_circ_04978表达上调,涉及矿物质吸收途径;circRNA0002366表达下调,涉及免疫反应中的中性粒细胞激活;circRNA3302表达上调,涉及细胞对铜离子的反应。这为研究IgAN的潜在发病机制提供了一种新的观点。此外,有研究者对IgAN的其他体液中差异表达的circRNA进行了研究。外泌体是由许多不同类型的细胞产生的囊泡,参与细胞间的信号转导。外泌体携带多种不同的物质,如细胞因子和miRNA等,被认为是疾病的生物标志物和预测预后的生物因子。Luan等[10]在IgAN患者尿液外泌体中发现了476个差异表达的circRNA,其中有450个上调,如chrY:13464932-13479648-、chr18:107887-108499+、chr8:4533990-4534156-等。chrY:13464932-13479648-和chr18:107887-108499+参与miRNA-148b的表达调控,而miRNA-148b过表达能够使core 1 β-1,3半乳糖转移酶1(core 1 beta1,3-galactosyltransferase,C1GALT1)的内源性表达显著降低,使IgA1糖基化发生异常[11];chr8:4533990-4534156-可能同时作为miRNA-29c和miRNA-29b的miRNA“海绵”抑制miRNA-29的表达,miRNA-29b/miRNA-29c可通过抑制Ⅲ型胶原蛋白α1抑制纤维化,因此,上述过表达的circRNA会加重肾小管间质纤维化程度。这些结果均提示circRNA参与IgAN的发生与发展,因此有希望通过抗circRNA药物来靶向抑制酶的水平以治疗IgAN[10]。

1.2 circRNA与IMN IMN的病理特征是大量的免疫复合物沉积在上皮细胞下,以及沿着肾小球毛细血管环周边的免疫球蛋白(Ig)G和补体颗粒沉积。其发病机制主要是由于补体激活及足细胞膜上特异性抗体抗磷脂酶A2受体、Ⅰ型血小板域蛋白7A等形成免疫复合物。近些年来,关于IMN的病理生理机制研究已深入至基因和分子水平。有研究[12]发现,与正常人相比,IMN患者外周血中circ_101319表达显著上调,circ_101319与miRNA-135a和miRNA-135b有许多结合位点,可调控miRNA-135家族的表达,而miRNA-135a和miRNA-135b的过表达会激活Wnt/β-catenin信号通路,并诱导小鼠肾足细胞中β-联蛋白(β-catenin)的核转位。同时,miRNA-135a和miRNA-135b的异位表达还可导致足细胞骨架错乱和足细胞损伤[13]。因此,circ_101319通过调控miRNA-135家族参与IMN中足细胞的损伤过程。采用ROC曲线及临床指标进行分析,结果提示,circ_101319可作为IMN的特异性诊断标志;circ_101319转录的基因区域包含MARK3、NFAT5等基因版,其也是环孢素和他克莫司的治疗靶点,故circ_101319也有望成为IMN的治疗靶点[12]。Sun等[14]研究发现,在血管紧张素Ⅱ导致的足细胞凋亡与膜性肾病肾组织内,circ_0000524水平均显著升高。进一步深入研究发现,circ_0000524能够通过抑制miRNA-500a-5p水平上调CXCL16的表达,进而促进足细胞凋亡。以上circRNA均参与足细胞的损伤,有可能是IMN潜在的生物标志物。

此外,Ma等[15]在IMN患者血清和尿液外泌体中分别发现了89个和60个差异表达的circRNA,这些circRNA大部分来源于内含子,相关的基因包括一些核仁小RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)基因,如SNORA25、SNORA51、SNORA31、SNORA70、SNORA75、SNORD112等。snoRNA是miRNA的前体,因此,推测在基因水平上,这些内含子源性的circRNA通过编码snoRNA的表达实现在转录和转录前修饰mRNA,调节基因表达,参与调控IMN的病理过程。其中,IMN血清外泌体中差异表达的circRNA chr7: 100550808|100551062促使靶基因mucin 3A(MUC3A)显著上调,从而参与IMN中免疫复合物的形成[15]。血浆、尿液及肾组织中的IMN特异性circRNA可能对该病的诊断和治疗具有潜在价值。

1.3 circRNA与FSGS FSGS在中国终末期肾病患者中约占3.2%～5.8%[16],在美国终末期肾病患者中约占20.0%,且其患病率在全球范围内呈上升趋势[17]。其病理特征主要为部分肾小球及部分毛细血管襻硬化,导致肾小球毛细血管襻闭塞和细胞外基质增多,病变可逐步扩展,最终导致终末期肾病。目前的治疗方法往往无法阻止疾病的长期进展,因此深入了解其发病机制、发现新的治疗靶点成为改善FSGS预后的可能途径。Gao等[18]在阿霉素肾病大鼠模型中鉴定出31个差异表达的circRNA,其中circRNA-213表达下调,而circRNA689、circRNA3217和circRNA4907等表达上调,经生物信息学分析,其靶点miRNA有miRNA-149-5p、miRNA-346、miRNA-342-3p、miRNA-125b-5p和miRNA-326-3p,这些miRNA具有调节细胞凋亡、增殖和迁移,以及肾脏纤维化等作用,涉及的细胞通路有VEGF信号通路、mTOR信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路等,这些通路与肾脏疾病的进展密切相关。Cui等[19]研究结果显示,在FSGS小鼠模型、体外研究及FSGS患者肾组织中,circZNF609表达水平均显著升高,与蛋白尿、血清胆固醇、尿素氮水平,以及足细胞损伤和肾脏纤维化均呈正相关,而miRNA-615-5p与上述变量的关系与circZNF609正好相反;circZNF609与miRNA-615-5p表达呈负相关,且这两个基因共同定位于肾小球和肾小管,因此推测circZNF609可能通过“海绵化”miRNA-615-5p增加胶原1(COL1)和TGF-β1的产生,加重肾纤维化与足细胞损伤。上述差异表达的circRNA均在肾组织中被发现,故应在FSGS患者血清中或尿液中行进一步研究以证实这些circRNA是否可作为一种无创性、易获取的生物学标志物。

2 circRNA与继发性肾小球疾病

2.1 circRNA与LN 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种好发于女性的自身免疫性疾病,由于体内存在多种针对自身抗原的抗体,这些抗体与抗原结合形成免疫复合物,沉积在器官和组织的血管壁上,激活补体系统,损伤机体多个器官及组织,而肾脏是最常受累的器官,大多数SLE患者在确诊后5年内出现LN,约5%～20%的LN患者在最初诊断为SLE的10年内发展为终末期肾病[20]。SLE的病因尚不完全清楚,而且非常复杂。越来越多的研究发现,circRNA在SLE的发生、发展中具有重要作用。Wang等[21]研究发现,circIBTK在SLE中低表达,且与SLE疾病活动性指数得分、抗ds-DNA滴度呈负相关,与补体C3水平呈正相关,可作为诊断、判断疾病活动及治疗有效性的特殊标志物;进一步研究发现,circIBTK有2个miRNA-29b的结合位点,miRNA-29b可诱导DNA去甲基化并通过抑制PTEN激活AKT信号通路参与SLE的进展,而高水平的circIBTK可逆转miRNA-29的去甲基化和AKT信号通路的激活,由此推测,circIBTK是治疗SLE的潜在靶点。Ouyang等[22]研究发现,与SLE患者相比,LN患者中有43个差异表达的circRNA,其中circRNA_002453在LN患者中表达显著上调,且与24 h尿蛋白定量水平及肾脏SLE疾病活动性指数得分呈正相关,但与补体C3、C4水平等无明显关系,推测circRNA_002453参与LN的疾病进展,且与LN的严重性密切相关,有望作为LN诊断及病情评估的特异性标志物。mmu_circRNA_34428的表达水平也与LN的严重程度相关,在重度LN中表达明显升高,因此推测其与系膜细胞增生及基质沉积密切相关;进一步研究发现,其可能是作为miRNA“海绵”抑制mmu-miRNA-34b-5p、miRNA-670-3p、miRNA-338-3p的表达和功能,从而促进LN的发生、发展,但具体机制有待于进一步研究[23]。circHLA-C、circZNF609、circEKL4、circFAM188A、circUBR5、circPDE4B和circSP100等在Ⅳ型LN患者肾组织中表达水平升高,且均与患者的某些临床指标相关,其中circHLA-C升高最为显著,与患者尿蛋白程度、新月体占比、疾病活动性指数得分等呈正相关;进一步分析circHLA-C与miRNA-155的关系,发现两者的结合位点非常匹配。因此,推测上调的circHLA-C可能在Ⅳ型LN新发病时作为miRNA-150的“海绵”参与LN的发生、发展,包括参与肾小球新月体的形成和蛋白的排泄[24]。这些研究加深了人们对LN发病机制的理解,为以后的研究提供了更广阔的思路。

2.2 circRNA与DN DN是糖尿病患者最主要的微血管病变之一。DN的发病机制十分复杂,涉及多个因素。有研究[25]结果表明,circEIF4G2在db/db小鼠的肾组织和高糖刺激的NRK-52E细胞中表达均上调,敲除circEIF4G2会通过miRNA-218/SERBP1通路抑制高糖导致的纤维化水平。circRNA也参与DN系膜细胞的病变,circ_0000491表达在DN小鼠和高糖诱导的小鼠系膜细胞中均显著上调。而circ_0000491的下调可抑制系膜细胞中波形蛋白、纤连蛋白、α-平滑肌肌动蛋白,以及Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原的升高,可逆转高糖诱导的系膜细胞中上皮钙黏素(E-cadherin)的降低。进一步研究[26]发现,circRNA_0000491可“海绵化”miRNA-101b,降低miRNA-101b水平,靶向调控TGF-β1受体参与系膜细胞的细胞外基质相关蛋白质的合成,提示circRNA_0000491可成为DN的有效治疗靶点。circLRP6也通过“海绵化”miRNA-205、上调高迁移率族蛋白-1和激活TLR4/NF-κB通路调控高糖诱导的系膜细胞增殖、氧化应激、细胞外基质沉积和炎症反应[27]。此外,circRNA_15698作为miRNA-185的“海绵”,可正向调控TGFβ1蛋白的表达,促进细胞外基质相关蛋白质的合成[28]。这些均提示circRNA的差异表达参与了DN的发生、发展,也为研究DN的发病机制提供了新的角度,为治疗的手段提供了新的思路。

3 结 语

近年来的许多研究已经揭示了circRNA的差异表达与肾小球疾病密切相关,可作为miRNA“海绵”、ceRNA网络等调控基因表达,但circRNA参与肾小球疾病的具体机制仍未完全阐明。随着二代测序技术和生物信息学分析的飞速发展,越来越多的circRNA及其作用将被一一揭晓,相信circRNA将成为诊断与治疗肾小球疾病的有力工具。