低温对黑斑侧褶蛙变态和植物血凝素反应的影响

李诺，伍亮，张志强

（安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036）

温度是影响两栖动物变态发育时长的主要环境因素之一，高温可促进蝌蚪生长发育，缩短变态时长，低温则延迟发育进程，延长变态时长[1-5]。黑斑侧褶蛙（Pelophylax nigromaculatus）是有重要经济价值的两栖动物，也是稻蛙综合种养的主要蛙种之一[6]。变态前后，蝌蚪的规格、对植物血凝素（PHA-P）的反应，受高温[3-5]、微塑料污染[7]和发育阶段[8]等多种因素影响。目前，关于低温条件下延迟蝌蚪发育的生理效应方面的研究报道较少[3]。

植物血凝素抗原（PHA-P 抗原）是一种有丝分裂原，能促进淋巴细胞增殖，通过评估被注射PHA-P 抗原部位皮肤组织的增厚程度，可整合反映两栖动物等不同类群脊椎动物的免疫功能[9-11]。现于2021 年6 月上旬，在安徽农业大学动物生理生态实验室，模拟黑斑侧褶蛙蝌蚪可能经历的极端低温环境，将发育至37 期的黑斑侧褶蛙蝌蚪，于8 ℃条件下分别处理5 和10 d 后，再转移至25 ℃条件下，继续饲养至变态完成期（46 期）幼蛙，以始终在25 ℃条件下饲养的蝌蚪为对照组，比较46 期幼蛙的存活率、变态时长、身体大小、PHA-P 的反应模式和最大反应值的出现时间，从免疫功能整合性变化的角度揭示低温延迟发育的机理，为提高黑斑侧褶蛙变态存活率、实现健康养殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

从合肥大圩镇捕获的黑斑侧褶蛙卵带，于60 L的塑料桶中饲养，加入曝气24 h 以上的自来水，2 d更换一次。用加热棒控制水温在（25±1）℃。每日用煮熟的青菜叶饲喂，直至发育至37 期蝌蚪。蝌蚪分期鉴定采用Gosner 提供的方法[12]。

1.2 饲料、试剂和设备

主要有蝌蚪饲料、PHA-P 抗原（Sigma L-8754,Sigma-Aldrich 公司产品）、塑料箱、加热棒、冰箱、电子数显卡尺、微量进样器和电子天平等。

1.3 试验设计

从60 L 塑料桶中随机选取发育至37 期的黑斑侧褶蛙蝌蚪210 只，用电子天平称量其体质量，数显卡尺测其体长、尾长，取规格相似的35 只蝌蚪，于塑料箱（34 cm×24 cm×18 cm）中，每箱35 只，共6 箱，蝌蚪的密度为3.2 只/L。其中，3 箱始终在水温（25±1）℃、水深13.5 cm 的环境下饲养，为A 组；剩余3 箱移入温度为（8±1）℃的冰箱内饲养，至第5 d 时，3 箱中分别取出一半蝌蚪，将其置于水温为（25±1）℃的条件下继续饲养，为B 组；剩余的蝌蚪继续在温度为（8±1）℃的冰箱内再饲养5 d，至第10 d时，再将3 箱中存活的蝌蚪置于水温为（25±1）℃的条件下继续饲养，为C 组。饲养期间，每2 d 根据3.2 只/L 的固定密度更换一次水体，每天定时喂食蝌蚪饲料，以塑料板和纱布制作成浮床，营造登陆环境，饲养至变态完成期46 期幼蛙为止。

1.4 指标测定

1.4.1 变态存活率和变态时长

统计A、B 和C 组每箱中从37 期蝌蚪发育至变态完成期46 期幼蛙的个体数，计算变态存活率和变态时长。

变态存活率（%）=发育至46 期幼蛙的个体数量×100%/初始时的蝌蚪数量；

变态时长（d）=发育至变态完成期46 期幼蛙的天数－37 期蝌蚪的处理天数。

1.4.2 体质量与体长

A、B 和C 组个体发育至46 期幼蛙时，每组每箱中分别取4、3 和2 只个体，用电子天平称量其体质量，数显卡尺测其体长。

1.4.3 对PHA-P 的反应

测A、B 和C 组每一只个体对PHA-P 的反应，以其平均值代表该箱的状态，以3 箱的平均值代表该组的状态。采用微量进样器，注射剂量为20 μL、质量浓度为2.5 g/L 的PHA-P 抗原溶液于46 期幼蛙大腿根部，以数显卡尺测量未注射时（0 h）大腿根部的厚度为基准值，此后在注射后每间隔1 h 测定被注射部位的厚度，每个间隔时间点连续测定3 次，取平均值，直至9 h。

对PHA-P 的反应（%）=（Xh 被注射部位的厚度－0 h 时该部位的厚度）×100%/0 h 时该部位的厚度。

1.5 数据处理与统计分析

用SPSS 19.0 进行数据处理和统计分析。用单因素方差分析比较不同延迟发育天数组黑斑侧褶蛙变态完成期幼蛙变态时长、体质量和体长，以及PHA-P 最大反应值的差异。同一处理组内，以注射前（0 h）和注射后9 h 内逐小时的测量时间点为组内因子，用重复测量方差分析比较不同测量时间点间PHA-P 反应的差异。结果均以（平均值±标准误）（Mean±SE）表示，P<0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 变态存活率、变态时长和身体大小

经统计得出，A、B 和C 组原分别有105、41 和43 只蝌蚪，至变态完成期46 期幼蛙时，A、B 和C组存活的总幼蛙数分别为92、18 和12 只。可得A、B和C 组的蝌蚪变态存活率分别为87.62%、43.90%和27.91%，呈下降趋势。低温对黑斑侧褶蛙变态时长、体质量和体长的影响见表1。由表1 可见，A—C组变态时长呈显著上升趋势（P<0.05），但体质量（P>0.05）、体长（P>0.05）均无明显的组间差异。

表1 低温对黑斑侧褶蛙变态时长、体质量和体长的影响①

①同列数据上标字母不同表示组间差异显著性（P<0.05）；字母相同表示组间差异不显著（P>0.05）。

2.2 PHA-P 反应

低温对黑斑侧褶蛙46 期幼蛙植物血凝素反应模式的影响见表2。由表2 可见，A 组注射后3 h，对PHA-P 的反应值最高，2 与3 h 时接近，均显著高于0 h 及6~9 h（P<0.05）；B 组注射后3 h 最高，与2 h时接近，均显著高于0 和1 h 及6~9 h（P<0.05）；C 组注射后4 h 最高，与3 h 时接近，均显著高于0 及7~9 h（P<0.05）。A、B 和C 组的PHA-P 最大反应值分别出现在注射后3，3 和4 h，但无明显的组间差异（P>0.05）。

表2 低温对黑斑侧褶蛙46 期幼蛙植物血凝素反应模式的影响①%

3 讨论

在安徽合肥地区，黑斑侧褶蛙通常在3 月底—4 月初孵化，经过2~3 个月，完成变态发育成幼蛙。蝌蚪常见于静水池塘、稻田等处，4—5 月份是蝌蚪发育的关键时间节点，也是水温剧烈波动的时间段，不但会经历热浪侵袭，而且可能面临低温胁迫[8]。随着低温处理天数增加，黑斑侧褶蛙变态完成期幼蛙的体质量、体长变化不明显，但存活率从延迟0 d 的87.62%下降至延迟5 d 的43.90%、延迟10 d 的27.91%，变态时间显著延长，从29.8 d 升至49.9 和58.3 d。说明低温胁迫天数的增加，显著影响了幼蛙的存活能力及发育至变态完成期幼蛙的个体数量，发育时间显著延长。幼蛙A、B 和C 组的体质量先降后升，体长呈下降趋势，但均无显著改变，说明被延长的发育期不利于其未来存活。

同时，随着低温胁迫天数的增加，存活下来的个体对PHA-P 的最大反应值无明显的组间差异，但C 组对PHA-P 的最大反应值出现在注射后4 h，而A 组和B 组均出现在注射后3 h，说明较长时间的低温胁迫，使变态完成期幼蛙对外界环境刺激的反应时间延长。幼蛙面对多变的陆地环境，被捕食的风险加大，不利于其未来存活。此前，关于黑斑侧褶蛙蝌蚪或幼蛙对PHA-P 反应模式和最大反应值的测定，常选用注射前（0 h）和注射后3，6，9 和12 h 测量时间点，发现37~43 期、44~46 期蝌蚪分别在注射后3 和6 h 达到最大反应值[8]，而在21~27 ℃饲养条件下，27 ℃饲养缩短了其变态时长，但PHA-P 最大反应值无组间差异[5]。然而，与低温处理延迟孵化12 d 的田野林蛙（Rana arvalis）蝌蚪相比，常温组蝌蚪对PHA-P 的反应的最高值高于延迟孵化组[3]，但该研究也只测定了预设的PHA-P达到高峰值时的时间点，即注射后2 d。

蝌蚪对PHA-P 抗原刺激的反应强度和峰值延迟或提前，被认为与免疫能力有关[11]。因此，能否精准界定PHA-P 最大反应值发生的时间点，是确定PHA-P 最大反应值出现时间的前提[13]。理论上，测量时间点间隔越小，准确度越高，但也意味着测量工作量和手握应激的次数也会增加[7]。本研究表明，每间隔1 h 测量1 次，所得的结果更为准确，也不会对幼蛙造成额外伤害，值得加以推广应用。

4 结论

低温诱导的延迟发育，显著降低了变态完成期幼蛙的存活率，延长了变态时长，对PHA-P 的反应有所后延，不利于幼蛙的未来存活。