p53转录调控靶基因GGT6对人结肠癌的影响

柳子朝，杜文静，2，李 莉*

1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 细胞生物学系 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005；2.山西医科大学 基础医学院 细胞生理学教育部重点实验室，山西 太原 030606

结肠癌是全球范围内常见的恶性肿瘤之一,据2020年的全球癌统计,结肠癌的发病人数及死亡人数在36种癌中均位列第5位,且其发病率和死亡率均较过去有明显上升[1]。p53是常见的抑癌基因,其通过靶基因控制包括细胞凋亡、细胞周期、DNA修复以及细胞代谢等多种生物过程[2-3]。目前,p53转录调控靶基因的寻找仍然是生命科学领域的研究热点。Nutlin是一种特异性靶向MDM2/p53相互作用的小分子抑制剂,通过稳定p53从而激活癌细胞周期阻滞和凋亡通路,在生物学实验中常常作为p53的激活剂使用[4]。本研究通过对Nutlin处理HCT116细胞得到的RNA-seq数据进行分析,预测并实验验证了GGT6是p53转录调控的靶基因。

GGT6是γ-谷氨酰转移酶(gamma glutamyl transferase,GGT)基因家族中的一员,目前针对其的研究还很少,主要是通过一些组学、生物信息学等研究筛选出了GGT6可能在肿瘤等疾病中有作用[5-7]。GGT6相关的调控基因鲜有报道,也没有其与结肠癌相关的研究报道,因此本研究就GGT6在结肠癌中的影响进行了生物信息学分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:人胚肾细胞系HEK-293T、人结肠癌细胞系HCT116和HCT8(ATCC细胞库)。

1.1.2 主要试剂:Nutlin-3a(Nutlin)(兰博利德公司),Lipofectamine®2000、Lipofectamine®RNAiMAX(Invitrogen公司),DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶(北京细工生物科技有限公司),BCA蛋白定量试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司),双荧光素酶报告检测试剂盒(Promega公司),anti-β-actin (Proteintech公司),anti-p53 (DO-1) (Santa Cruz Biotechnology公司),总RNA提取试剂盒、FastKing RT 第一链合成试剂盒(Tiangen公司),SYBR Green PCR Master Mix(ABM公司),siRNA:sip53#1,5′-GCUGUGGGUUGAUUCCACATT-3′; sip53#2, 5′-GCAUCUUAUCCGAGUGGAATT-3′; sip53#3,5′-GCAUCUUAUCCGAGUGGAATT-3′(上海吉玛制药技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及处理:将细胞用含10%血清和抗生素的DMEM高糖培养基于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养,传代2～3 d/次,复苏细胞至少传2代后进行实验。药物处理:10 μmol/L Nutlin处理24 h后收样,对照组加入等体积的DMSO;siRNA转染:6孔板每孔使用Lipofectamine®RNAi MAX转染试剂3 μL,对应20 μmol/L siRNA 3 μL,转染48 h后收样。

1.2.2 RNA-seq的测序及生物信息学分析:10 μmol/L Nutlin处理HCT116细胞24 h后收样(对照组加入等体积的DMSO,各两组平行样本)。提取细胞总RNA,经质检合格后,由诺禾致源公司完成HiSeq测序并返回测序结果。对测序结果利用R语言DESeq2包进行差异表达分析,clusterProfiler包进行GO、KEGG与GESA富集分析。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测细胞内mRNA的水平:用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,取1 μg逆转为cDNA,使用qPCR Mix配制反应体系进行实时定量PCR。以ACTB作为内参,以CDKN1A作为p53转录靶基因的阳性对照。引物序列为,ACTB:5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′和5′-CTCCTTA ATGTCACGCACGAT-3′; CDKN1A:5′-AGGTGGAC CTGGAGACTCTCAG-3′和5′-TCCTCTTGGAGAAGAT CAGCCG-3;GGT6:5′-ACATCAGAGGCGCTGGTTC-3′和5′-CAGAGCCCAAGCTTCCTGTC-3′。

1.2.4 Western blot检测细胞内蛋白的表达:收样细胞中加入细胞裂解液于冰上裂解30 min,离心取上清,BCA进行蛋白定量,加入2×蛋白上样缓冲液后煮沸。蛋白样品用SDS-PAGE胶电泳,转移到PVDF膜上,在5% BSA中封闭,并用对应抗体孵育后进行曝光检测。

1.2.5 双荧光素酶报告实验验证靶向关系:利用在线网站JASPAR(https://jaspar.genereg.net)预测p53在GGT6启动子区的结合调控位点(RE) 并选出评分较高的。以HEK-293T细胞的基因组为模板,分别设计引物克隆含RE的约200 bp的DNA片段构建在pGL3-Basic-vector质粒上。HEK-293T细胞在24孔板中进行实验,每孔添加Lipofectamine®2000 0.5 μL,转染Renilla vector (pRL-CMV)质粒10 ng,pGL3相关质粒200 ng,pRK5-flag-vector或pRK5-flag-p53质粒300 ng。24 h后收样,按双荧光素酶报告检测试剂盒说明书进行检测。

1.2.6 人结肠癌数据的生物信息学分析:在UCSC Xena 数据库中选择含453例结肠癌组织和41例癌旁组织的基因表达和患者临床信息的TCGA-COAD数据集,其中GGT6的mRNA表达数据用以分析GGT6在结肠癌组织与癌旁组织的表达差异,利用R语言survival包进行生存分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Nutlin处理激活p53信号通路

从Nutlin (实验组)和DMSO(对照组)处理HCT116细胞的RNA-seq数据筛选出了758个差异基因(|log2FoldChange|>1, padj<0.05),其中214个基因上调,544个基因下调(图1A,B)。这些差异表达基因经生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)3方面的GO富集分析后,结果表明经Nutlin处理的HCT116细胞中,细胞周期、DNA复制及染色体分离等过程的相关基因表达存在差异(图 1C)。KEGG(图 1D)和GSEA(图1E)分析也提示这些差异基因会富集在上述相关过程,同时KEGG分析也表明Nutlin处理后p53信号通路发生明显变化。

A,B.volcano plot(A) and heatmap(B) by differential gene analysis of RNA-seq data in HCT116 cells treated with DMSO or Nutlin; C.GO enrichment analysis; D.KEGG enrichment analysis; E.GSEA analysis.图1 Nutlin处理HCT116细胞的差异基因及富集分析Fig 1 Differential gene and enrichment analysis in HCT116 cells treated with Nutlin

2.2 p53正调控GGT6基因的表达

在Nutlin处理HCT116细胞的RNA-seq差异表达基因的分析数据中,GGT6基因表达明显上调(Nutlin vs DMSO,log2FoldChange=4.750618,padj=7.70E-05)。接着选用HCT116和HCT8两种结肠癌细胞系进行验证,发现Nutlin处理促进p53蛋白表达,同时GGT6的mRNA表达升高(其中CDKN1A为已报道的p53转录调控的靶基因)(图 2A～D)。用3对p53的siRNA敲降p53后,GGT6的mRNA表达被抑制(图 3A～D)。

A,B.protein levels of p53(A) and relative mRNA expression levels of GGT6 and CDKN1A (B)after treatment with 0 or 10 μmol/L Nutlin in HCT116 cells; C,D.protein levels of p53(C) and relative mRNA expression levels of GGT6 and CDKN1A (D)after treatment with 0 or 10 μmol/L Nutlin in HCT8 cells; *P<0.001 compared with 0 μmol/L Nutlin.图2 Nutlin处理后p53和GGT6的表达情况Fig 2 Expression of p53 and GGT6 after Nutlin treatment

A,B.protein levels of p53(A) and relative mRNA expression levels of GGT6 and CDKN1A (B)after transfection with siRNA of NC or p53 in HCT116 cells; C,D.protein levels of p53(C) and relative mRNA expression levels of GGT6 and CDKN1A (D)after transfection with siRNA of NC or p53 in HCT8 cells; *P<0.01, **P<0.001 compared with NC.图3 siRNA转染后p53和GGT6的表达情况Fig 3 Expression of p53 and GGT6 after siRNA transfection

2.3 GGT6是p53转录调控的靶基因

在JASPAR网站预测筛选出了评分较高的3个p53蛋白在GGT6启动子区可能的结合调控位点的序列(分别命名为RE1、RE2、RE3,图 4A)。在双荧光素酶报告实验中仅序列RE1的荧光素水平在p53过表达后明显升高(图 4B)。

A.schematic representation of human GGT6 gene with three potential p53 response elements (RE1, RE2 and RE3); B.dual luciferase reporter experiment for RE1, RE2, RE3 and CDKN1A-RE(positive control); *P<0.001 compared with pRK5-flag-vector.图4 双荧光素酶实验检测p53对GGT6启动子区的结合Fig 4 The binding of p53 to the GGT6 promoter region detected by dual luciferase assay

2.4 GGT6在结肠癌中的表达与患者的预后分析

对TCGA数据库中453例结肠癌组织与41例癌旁组织的mRNA表达数据分析显示,GGT6在结肠癌中的表达显著低于癌旁(图 5A)。在41对配对的结肠癌与癌旁组织中,GGT6在结肠癌组织中表达也较低(图 5B)。对TCGA数据库中有总体生存数据的430例结肠癌患者的预后进行总生存期(OS)分析,表明GGT6高表达患者的总体生存时间较GGT6低表达患者更长。

A.expression of GGT6 in 453 COAD tissues and 41 normal tissues from TCGA database; B.expression of GGT6 in 41 pairs of COAD and adjacent normal tissues from TCGA database; C.Kaplan-Meier survival curve comparing the overall survival(OS) for different GGT6 expression subtypes in COAD patients from TCGA database; *P<0.001 compared with normal tissues; N.normal; T.tumor.图5 GGT6在结肠癌中的表达与患者的预后分析Fig 5 The expression of GGT6 and the prognosis of patients in COAD

3 讨论

p53作为众所周知的肿瘤抑制基因以多种方式抑制肿瘤的生长,其主要作为转录因子参与调节各种细胞生命活动以及代谢过程相关的基因[3,8]。尽管在基于p53的肿瘤治疗方面不断取得进展,但仍存在许多挑战,寻找最终能够进入临床的高效和选择性药物的工作仍在进行中[9]。不管是其转录靶基因还是涉及癌的相关研究,都一直是生命科学领域的热点问题。本研究揭示了p53在转录调控GGT6中的作用,为p53的靶向调控提供了一个潜在的研究方向。

γ-谷氨酰转移酶(GGT)在谷胱甘肽合成中占有重要地位,其在氧化应激中的作用已得到充分研究,证据表明GGT失调产生的活性氧促进肿瘤进程,在不同浓度下,其在肿瘤血管生成、转移和生存中发挥着重要作用[10]。虽然GGT6属于GGT基因家族,但据报道此家族中仅GGT1和GGT5被证明能表达具有酶活性的蛋白,以GGT6作为主要研究对象的文献还少有发表[11]。本研究对TCGA数据库中结肠癌相关组织的mRNA表达数据进行分析,与正常结肠组织相比,GGT6在结肠癌中的表达降低且GGT6高表达患者的总体生存时间较GGT6低表达患者更长,据此推断GGT6可能是结肠癌的一个抑癌基因,为今后结肠癌治疗提供了潜在的治疗靶点。