基因2型鹅星状病毒EvaGreen荧光定量一步法RT-PCR的建立与应用

赵 磊, 刘廷惠, 杨贝奇, 张留君, 刘欣超, 张训海

(安徽科技学院 家禽疫病防控监测安徽省重点实验室,安徽 凤阳 233100)

鹅星状病毒(Goose astrovirus,GoAstV)属于星状病毒科禽星状病毒属,是一类无囊膜的单股正链RNA病毒,其基因组全长7.1～7.4 kbp,包含3个开放阅读框(ORF1a、ORF1b和ORF2),ORF2基因编码病毒结构蛋白以包裹核酸形成病毒衣壳,是GoAstV的基因分型依据[1-2]。GoAstV分为2种基因型(GoAstV-1和GoAstV-2),二者的衣壳蛋白氨基酸序列同源性仅为40.4%～41.7%。GoAstV-1型是以导致鹅肠炎的FLX株为代表株的经典型鹅星状病毒[3]。GoAstV-2型是近年来引发雏鹅以痛风为主要病症的新型鹅星状病毒,其主要侵害4～20日龄的雏鹅,发病率可达80%,死亡率可达50%,病鹅因肾功能障碍导致内脏、关节、肌肉等部位发生严重白色尿酸盐沉积,耐过鹅易继发细菌感染,后期生长缓慢,料肉比升高,出栏合格率显著降低[4-6]。另有报道发现GoAstV-2感染番鸭、樱桃谷鸭、鸡并造成痛风症状[7-9],表明它已具备跨越物种屏障的能力,成为我国养禽业面临的重要疫病之一。

传统RT-PCR方法属于终点法,只能对病毒感染定性,不能定量,灵敏度也较低,而具备简便、快速、高通量、高灵敏度等优点的荧光定量RT-PCR方法被广泛用于RNA病毒的定性与定量检测。邱思语等[10]和白彩霞等[11]分别应用SYBR Green I染料法建立了检测GoAstV-2荧光定量RT-PCR方法,Wan等[12]、Yin等[13]和Yuan等[14]分别应用TaqMan探针法建立了检测GoAstV-2荧光定量RT-PCR方法。染料法相比探针法成本低,另外在探针法中,由于RNA病毒易突变,当突变位点位于探针区域时,探针与模板结合能力下降而易导致假阴性结果影响其准确性。EvaGreen、LC Green和Syto9是一类新型饱和荧光染料,对PCR的抑制性远小于不饱和荧光染料SYBR Green I,从而获得更稳定的扩增信号,可精确反映目的片段的熔解温度TM值,适合高分辨率熔解曲线分析和区分扩增产物的特异性[15]。目前,未见采用饱和荧光染料法对GoAstV-2进行检测的报道,本研究以ORF2基因序列为靶标,建立以EvaGreen为染料的荧光定量一步法RT-PCR检测GoAstV-2方法,为禽类GoAstV-2感染的快速鉴别诊断和净化检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 主要材料

新城疫病毒活疫苗(NDV)购自哈药集团生物疫苗有限公司;H5型禽流感病毒血凝抗原(AIV-H5)购自哈尔滨维科生物技术开发公司;鸡呼肠孤病毒活疫苗(ARV)和番鸭细小病毒活疫苗(MDPV)购自广东温氏大华农生物科技有限公司;番鸭呼肠孤病毒活疫苗(MDRV)购自青岛易邦生物工程有限公司;鹅坦布苏病毒(TMUV)、鹅呼肠孤病毒(GRV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、鹅细小病毒(GPV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)和GoAstV-2 AHDY2020株均为本实验室分离保存。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自赛默飞世尔科技公司;20×EvaGreen饱和荧光染料购自BioTium公司;HiScript®III U+One Step qRT-PCR Probe Kit和Vazyme®Virus DNA/RNA Extraction Kit 2.0购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、Taq DNA聚合酶、dNTP、10×Taq Buffer、DNA Marker、pMD18-T载体均购自TaKaRa公司。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank公布的禽星状病毒全基因组序列,应用MAGE6.0多序列比对软件分析GoAstV-2型毒株ORF2特异性区域,用Primer5.0软件设计特异性检测GoAstV-2引物,F：5’-TTTCAGACGCCCAGATAGACAGC-3’,R：5’-CCAAACACCAGGAATGAGCACG-3’,预期扩增片段长度为262 bp,引物由南京金斯瑞生物公司合成。

1.3 重组质粒标准品构建

取含GoAstV-2 AHDY2020株的鹅胚尿囊液,按MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒说明书提取病毒RNA,并按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书用Oligo(dT)引物反转录为cDNA。应用GoAstV-2引物F/R进行PCR扩增,反应体系：1 μL 10×rTaq buffer、1 μL 2.5 mmol/L dNTP、0.8 μL 5 U/μL rTaq DNA聚合酶、10 μmol/L上下游引物各1 μL、1 μL模板cDNA,用ddH2O补足10 μL。反应程序：95 ℃预变性1 min,95 ℃变性3 s、65 ℃退火兼延伸8 s,循环35次。PCR产物经凝胶电泳后,对目的片段进行切胶和DNA胶回收,再连接pMD18-T载体,转化TOP10感受态大肠杆菌,PCR鉴定阳性克隆菌进行摇菌增殖,提取重组质粒并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。用NanoDrop One超微量核酸测定仪测定重组质粒标准品的浓度为8.4 ng/μL,根据拷贝数计算公式换算成重组质粒拷贝数为2.58×109copies/μL。

1.4 荧光定量一步法RT-PCR反应参数优化

用GoAstV-2 AHDY2020株鹅胚尿囊液提取的RNA(10 ng/μL)为模板,应用HiScript®III U+One Step qRT-PCR Probe Kit试剂盒进行荧光定量一步法测定,在ABI QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪上选择“FAST”升降温模式进行,反应体系为20 μL：4 μL 5×One Step U+Mix、1 μL One Step U+Enzyme Mix、1 μL 20× EvaGreen、1 μL RNA模板,F/R引物浓度筛选分别为0.3、0.5、0.7、0.9 μmol/L,用RNase-free ddH2O补足20 μL。反应程序为：55 ℃逆转录5 min,95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s、退火延伸温度筛选分别以60、61、62、63、64、65 ℃维持20 s,循环40次,熔解曲线：从60 ℃以0.15 ℃/s上升至95 ℃。根据扩增曲线最小CT值确定最佳反应参数。

1.5 标准曲线和熔解曲线的建立

将重组质粒标准品进行10倍系列稀释(2.58×101～2.58×107copies/μL)作为模板,用优化后的荧光定量一步法RT-PCR检测,建立标准曲线和熔解曲线。结果判定标准：当样品有典型的扩增曲线、CT值<40、熔解曲线TM值在(85.5±0.5) ℃,3个条件同时满足时,判为阳性,否则均判为阴性。

1.6 敏感性检测

将重组质粒标准品10倍系列稀释成2.58×100～2.58×107copies/μL共8个稀释度作为模板,用优化建立的荧光定量一步法RT-PCR检测,确定该方法的拷贝数最低检测限。

1.7 特异性检测

用VNP-32P型全自动核酸提取仪及Vazyme®Virus DNA/RNA Extraction Kit 2.0试剂盒提取实验室保存的GoAstV-2、NDV、AIV-H5、ARV、TMUV、GRV、MDRV、IBDV、GPV、MDPV和FAdV-4的DNA/RNA,同时设置阴性对照(H2O),用建立的荧光定量一步法RT-PCR进行扩增,检测该方法的特异性。

1.8 重复性检测

以10倍系列稀释的2.58×103～2.58×106copies/μL共4个稀释度的重组质粒标准品为模板,分别进行同一次模板设3个重复的批内试验和同一试验条件下3个不同时间段的批间试验,计算模板CT值的标准差和变异系数。

1.9 临床组织样品检测

采集临床GoAstV-2感染病死鹅的腺胃、脑、肾脏、小肠、胰腺、脾脏、心脏、肺脏、肝脏和腿肌组织各3份,经组织匀浆后,于10 000 r/min离心5 min,取200 μL上清液,用Vazyme®Virus DNA/RNA Extraction Kit 2.0试剂盒提取各组织病料中DNA/RNA,用建立的荧光定量一步法RT-PCR进行检测。收集临床送检病死鹅的组织样品共32份,匀浆后用上述试剂盒提取病毒核酸,用建立的荧光定量一步法RT-PCR进行检测,将检测阳性样品按常规RT-PCR进行扩增和产物测序验证。

2 结果与分析

2.1 重组质粒标准品的鉴定

用GoAstV-2引物对重组质粒进行PCR扩增,显示扩增产物为262 bp条带(图1),与预期大小一致。

图1 GoAstV-2 AHDY2020株二温式PCR检测结果Fig.1 Results of two-temperature PCR for detection of GoAstV-2 AHDY2020 strain注：M为DL2000;1为GoAstV-2 AHDY2020株扩增结果;2为阴性对照。

2.2 荧光定量一步法RT-PCR方法反应参数优化结果

经优化确定的GoAstV-2 EvaGreen荧光定量一步法RT-PCR反应体系(20 μL)：4 μL 5×One Step U+Mix、1 μL One Step U+Enzyme Mix、1 μL 20× EvaGreen、0.3 μmol/L F/R引物,1 μL RNA模板,用RNase-free ddH2O补足20 μL。反应程序为：55 ℃逆转录5 min,95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s、65 ℃退火延伸20 s,循环40次,最后进行熔解曲线分析程序。

2.3 标准曲线和熔解曲线的建立

以优化建立的GoAstV-2 EvaGreen荧光定量一步法RT-PCR对2.58×101～2.58×107copies/μL重组质粒标准品进行检测,绘制的标准曲线CT值与质粒含量线性关系良好,其回归方程为Y=-3.413X+40.462,相关系数R2=0.995,扩增效率为96.3%(图2)。熔解曲线分析显示,其TM值在(85.5±0.5) ℃时出现特异性单峰(图3)。

图2 荧光定量一步法RT-PCR标准品标准曲线Fig.2 Standard curve of the one-step qRT-PCR

图3 荧光定量一步法RT-PCR标准品熔解曲线Fig.3 Melting curve of the one-step qRT-PCR

2.4 灵敏度检测结果

应用GoAstV-2 EvaGreen荧光定量一步法RT-PCR对2.58×100～2.58×107copies/μL重组质粒标准品检测结果显示,该方法的拷贝数最低检测限为25.8 copies/μL(图4)。

图4 荧光定量一步法RT-PCR灵敏度试验Fig.4 Sensitivity test of the one-step qRT-PCR注：标准质粒浓度(1～8分别为2.58×107～2.58×100 copies/μL)。

2.5 特异性检测结果

以提取的GoAstV-2、NDV、AIV-H5、ARV、TMUV、GRV、MDRV、IBDV、GPV、MDPV和FAdV-4等11种病原核酸为模板,用所建立的方法对其检测结果显示,仅GoAstV-2被检测为阳性,其它病原均为阴性,其中NDV、AIV-H5、TMUV、MDRV、IBDV、GPV、MDPV和FAdV-4在35次循环后出现较低的非特异性扩增荧光信号,但熔解曲线TM值均不在(85.5±0.5) ℃,均判为阴性(图5～6)。

图5 荧光定量一步法RT-PCR特异性试验Fig.5 Specificity test of the one-step qRT-PCR注：1～12分别为GoAstV-2、NDV、AIV-H5、ARV、TMUV、GRV、MDRV、IBDV、GPV、MDPV、FAdV-4和水。下同。

图6 荧光定量一步法RT-PCR特异性试验熔解曲线Fig.6 Melting curve of specificity test of the one-step qRT-PCR

2.6 重复性检测结果

组内重复试验和组间重复试验结果显示(表1),组内变异系数为0.47%～1.04%,组间变异系数为0.71%～1.73%,二者变异系数均小于2%,表明所建立的方法具有良好的重复性。

表1 GoAstV-2荧光定量一步法RT-PCR重复性试验结果Table 1 Repeatability results of the one-step qRT-PCR for detection of GoAstV-2

2.7 临床组织样品检测结果

对感染GoAstV-2病死鹅的10种组织含毒量检测显示(图7),10种组织均可检测出GoAstV-2,其中肾脏含病量最高(2.48×1011copies/g),为脾脏含毒量(4.64×1010copies/g)的5.3倍,为肝脏含毒量(6.33×109copies/g)的39.2倍,脑组织和腿肌含毒量相对较低(9.87×107和6.32×107copies/g),结果表明,该方法具有良好的组织检测适应性,可用于样品的定量检测。对临床送检的32份病死鹅组织样品检测与熔解曲线分析显示(图8),9份为GoAstV-2阳性,占比为28.1%,其中8份样品(1～8号)为强阳性,1份样品(9号)为弱阳性,阳性样品经测序验证均为GoAstV-2序列;其余样品的熔解曲线TM值均不在(85.5±0.5) ℃范围内,均为阴性。

图7 荧光定量一步法RT-PCR检测不同组织中病毒RNA拷贝数Fig.7 Viral RNA copies in different tissues detected by one-step qRT-PCR

图8 荧光定量一步法RT-PCR检测临床组织样品的熔解曲线Fig.8 Melting curve of clinical tissues detected by the one-step qRT-PCR注：32份(1～32)送检的临床病死鹅组织样品。

3 结论与讨论

禽星状病毒感染禽类可引起肠炎、肾炎、肝炎等多种病症,GoAstV-2为2017年新发现的引发雏鹅痛风病症的鹅星状病毒,GoAstV-2感染给我国安徽、福建、山东、江苏、广东等养鹅主产区造成了巨大的经济损失。流行病学调查发现,临床无症状的种鹅群也存在GoAstV-2感染,并证实GoAstV-2型SDPY株可通过鹅胚垂直传播[16]。GoAstV-2感染鹅胚除了一部分在孵化期间发生死胚而不能出壳外,还有相当一部分是能够孵化出壳的,进而成为携带GoAstV-2的病弱雏,健康鹅在孵化出壳后接触病弱雏的蛋壳、胎粪、鹅体等形成出雏器内早期GoAstV-2交叉感染,雏鹅最早可见于4日龄开始发病。当感染雏鹅在临床出现典型痛风病症后,业已错过该病的最佳防治期,对该病的早期鉴别诊断和种源净化检测尤为重要。

目前,针对GoAstV-2的检测方法包括病毒分离、普通RT-PCR、荧光定量RT-PCR(染料法和探针法)、环等温扩增技术(LAMP)等[17-18],其中荧光定量PCR检测方法以其快速、高灵敏度、高通量、可定量等优点而被广泛用于病原微生物的检测,配合全自动核酸提取设备,可快速且高通量地处理大量临床样本。本研究针对GoAstV-1和GoAstV-2的ORF2基因差异位点,设计特异性扩增GoAstV-2的高退火温度引物,以稳定性更好的饱和荧光染料EvaGreen和HiScript®III U+One Step qRT-PCR Probe Kit试剂盒优化建立检测GoAstV-2的荧光定量一步法RT-PCR方法。用构建的重组质粒标准品对该方法进行性能评估显示,绘制的标准曲线具有良好的线性关系,熔解曲线呈单一峰,TM值在(85.5±0.5) ℃。熔解曲线TM值是染料法中判定结果的关键所在,SYBR Green I不饱和染料存在染料重排而不能精确反映双链DNA解链的情况,本研究方法应用EvaGreen饱和荧光染料不存在染料重排,可有效区分非特异性扩增产物。该方法对标准质粒最低检测限为25.8 copies/μL,与已建立的SYBR Green I染料法以及TaqMan探针法灵敏度相当[10-14]。另外,为防止扩增产物污染水、引物、实验器材以及形成气溶胶污染,本研究建立的体系应用一步法使逆转录和qPCR反应在一管内完成,降低了污染的风险,同时在该体系还引入dUTP/UDG酶防污染系统和热启动Taq聚合酶,消除了由扩增产物污染的风险,从而保证检测的特异性和准确性。

本研究建立的方法对GoAstV-2感染后病死雏鹅的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑等10种组织样品均可检测到GoAstV-2,其中肾脏的含毒量最高,为脾脏的5.3倍和肝脏的39.2倍,为脑组织的2 500倍和腿肌的3 900倍,提示肾脏为GoAstV-2主要靶器官且各组织器官含毒量有明显差异。然而,张清水[6]用常规RT-PCR方法从GoAstV-2感染病死雏鹅8种组织中均检测到病毒,由于该方法不能定量检测,其认为病毒对雏鹅组织有广泛的侵嗜性。邱思语等[10]应用荧光定量PCR检测8种组织样品显示肾、脾和肝含毒量较高,心和大脑含毒量低,与本研究的组织含毒量趋势一致。徐蓉等[19]在动物回归试验中,发现未死亡或未出现痛风的雏鹅肾脏都表现发白、肿胀和炎性细胞浸润,也指示了肾脏为GoAstV-2主要靶器官。本研究方法对临床32份送检的病死鹅组织样品检测和测序验证显示,9份为GoAstV-2阳性,其中9号样品为弱阳性,而应用常规RT-PCR方法对9号样品直接扩增结果却为阴性,可见荧光定量RT-PCR方法更适于临床样品的准确检测。

综上,本研究建立的EvaGreen饱和染料一步法qRT-PCR检测GoAstV-2方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、防污染等特性,适用于禽类临床样品的GoAstV-2感染定量检测。