大别山产多花黄精提取物抗氧化活性的比较研究

何晓梅, 倪梦茹, 汪军杰, 朱健忠, 宋 程, 侯雪芹, 刘昌利

(1.皖西学院 生物与制药工程学院,安徽 六安 237012;2.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室,安徽 六安 237012)

中药黄精为百合科黄精属草本植物多花黄精(PolygonatumcyrtonemaHua)、滇黄精(PolygonatumkingianumColl et Hemsl)和黄精(PolygonatumsibircumDelar. ex Redoute)的干燥根状茎,是我国传统中药,收录于《中国药典》2020年版一部[1]。其性甘味平,具有补气益肾、健脾益精、滋阴润肺、延年益寿的功效[2],含有多糖、皂苷、黄酮、生物碱、醌类化合物、植物甾醇、木脂素、酚类、氨基酸和微量元素等[3]成分,具有抗氧化、提高免疫力、降血糖、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、抗衰老、保护肾功能、改善记忆力等[4-5]药理作用;此外,黄精的块茎可以制成茶或药酒,或与肉类一起烹饪[6],因此黄精是具有药用价值和营养价值的药食同源植物[7]。目前对黄精生物活性成分的研究主要集中于多糖,包括黄精多糖的提取、纯化、化学结构分析及药理评价[8-9],而通过水提、醇沉、离心、洗涤,获得醇沉物(制备黄精多糖的原料)后,上清部分弃之不用。研究表明黄精水提物中含有较多的黄酮和酚类物质[10-12],而黄酮和酚类物质是植物中广泛存在的抗氧化活性成分。多花黄精主产于贵州、湖南、安徽、云南、浙江、福建等省,生长于山地林下、灌丛或山坡的半荫处。近年来,由于市场对中药黄精需求量的增加,引发药农过度采挖,导致野生黄精资源濒临枯竭,同时黄精的品质和产量还受其生长环境和栽培方式的影响[13]。基于上述原因,当前大别山区林下栽培多花黄精的产量已经提高很多,开展黄精深加工,提高产品附加值,积极推进大别山区黄精产业高质量发展具有重要意义。本研究以大别山林下仿野生多花黄精为研究对象,通过水提醇沉洗涤分别获得醇沉物和上清液浓缩冷冻干燥干粉,测定醇沉物和上清干粉中多糖、总酚和黄酮含量,以还原力和清除自由基能力为指标,探究二者的抗氧化活性,旨在筛选最佳活性部位,为进一步研究和利用多花黄精作为天然抗氧化剂提供理论依据,也为提高多花黄精的附加值奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

多花黄精(金寨润元生物科技有限公司);葡萄糖标准品(上海源叶生物科技有限公司);芦丁标准品(上海如吉生物科技发展有限公司);2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS,上海蓓琅生物科技有限公司);L-抗坏血酸(Vc,索莱宝科技有限公司);1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH,上海鼓臣生物技术有限公司);其他试剂均为国产分析纯。

UV-5200紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);DD5型台式大容量低速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司);FD-1A-50型真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 多花黄精提取物制备 将多花黄精根、茎粉末水提溶液醇沉、离心、洗涤后获得黄精醇沉物和上清液[14],其中,黄精醇沉物挥干乙醇后用适量蒸馏水溶解,置于-20 ℃保存,醇沉上清液减压浓缩到一定体积,置于-20 ℃冰箱冷冻,然后将冻实的二者置于冷冻干燥机(-60 ℃,20 Pa)冷冻干燥得醇沉物和上清干粉,备用。

1.2.2 提取物各组分含量的测定

1.2.2.1 标准曲线建立 采用蒽酮-硫酸法测定多糖含量[15],建立葡萄糖浓度(x)-吸光度(y)标准曲线,得回归方程：y=7.691x+0.098,R2=0.997 4,葡萄糖质量浓度在0～0.10 mg/mL内线性关系良好。采用FoLin-CiocaLteu比色法测定总酚含量,建立没食子酸质量浓度(x)-吸光度(y)标准曲线,得回归方程：y=0.018x+0.028 2,R2=0.991 7,没食子酸质量浓度在0～50 μg/mL内线性关系良好。采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定总黄酮含量,建立芦丁质量浓度(x)-吸光度(y)标准曲线,得回归方程：y=1.358 7x+0.000 8,R2=0.991 7,芦丁质量浓度在0～0.10 mg/mL内线性关系良好。

1.2.2.2 提取物各组分含量测定 分别配制合适质量浓度的醇沉物和上清干粉溶液,与各标准曲线绘制同法依次测定各样品溶液中多糖、总酚和总黄酮吸光度(OD584 nm、OD763 nm、OD510 nm),代入回归方程计算出各样品中多糖、总酚和总黄酮的含量。

1.2.3 体外抗氧化活性测定

1.2.3.1 铁离子还原能力测定 向试管中依次加入0.2～2.0 mL待测液(30 μg/mL Vc溶液、10 mg/mL醇沉物溶液、2 mg/mL上清干粉溶液),加PBS(pH 6.6)至3.0 mL,加1.5 mL 10%(g/mL)铁氰化钾溶液,旋涡混合后于50 ℃水浴20 min,迅速水浴冷却至室温,加1.5 mL 10%(V/V)三氯乙酸、2.5 mL无水乙醇、0.3 mL 0.1%三氯化铁溶液,旋涡混合后静置5 min。于700 nm下测各样品吸光度,重复3次取平均值[16]。样品还原能力强弱以吸光度大小表示。

1.2.3.2 ABTS+·清除能力测定 精密配制7 mmol/L ABTS溶液与2.5 mmol/L过硫酸钾溶液,等体积混合后避光反应12 h以上,得ABTS+·储备液[17]。将储备液稀释10倍至734 nm下吸光度为0.700±0.020,即得ABTS+·工作液。取干净试管,向每组试管中分别加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL待测液(40 μg/mL Vc溶液、20 mg/mL醇沉物溶液、40 mg/mL精制多糖溶液、5 mg/mL上清干粉溶液),加去离子水至1.0 mL,加ABTS+·工作液5.0 mL,混匀后避光反应10 min,于734 nm下测吸光度。记0号组吸光度为A0,1～10组吸光度为An(n取1～10),计算各组样品清除率,取平均值。

1.2.3.3 DPPH·清除能力测定 取干净试管,向每组试管中分别加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL待测液(20 μg/mL Vc溶液、10 mg/mL醇沉物溶液、30 mg/mL精制多糖溶液、2 mg/mL上清干粉溶液),加去离子水至2.0 mL,加2.0 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液,混匀后避光反应30 min,于517 nm测吸光度。记0组吸光度为A0,1～10组吸光度为An(n取1～10),计算各组样品清除率,取平均值[18]。

1.2.4 抗氧化能力 分别计算半抑制浓度(IC50)、半数效应浓度(EC50)和自由基清除能力(AE),比较醇沉物和上清干粉的抗氧化能力[19]。

2 结果与分析

2.1 提取物得率及其主要活性成分含量

由醇沉物和上清干粉二者得率可知(表1),多花黄精水溶性物质得率达到58.45%,其中醇沉物得率约为上清干粉得率的2.5倍。醇沉物和上清干粉中都含有较高含量的多糖,且上清干粉中多糖含量高于醇沉物,可能还有较多的多糖溶于乙醇溶液而没有沉淀于醇沉物中[20]。因此,上清干粉中总酚、黄酮含量均高于醇沉物。

表1 提取物得率及其主要活性成分含量Table 1 Extraction yield and content of its main active components

2.2 抗氧化活性研究

2.2.1 铁离子还原能力 还原性物质将铁氰化钾中的三价铁还原成二价铁,产生亚铁氰化钾,游离的Fe3+与亚铁氰化钾结合生成蓝色的普鲁士蓝,在700 nm下产生最大吸收。相同条件下,不同浓度与种类的还原性物质还原产生亚铁氰化钾的多少,体现了还原能力的强弱,并通过与Fe3+结合后的吸光度大小体现出来,吸光度越大还原能力越强[21]。以Vc为阳性对照,各样品对铁离子还原能力测定结果如图1～3,各样品的还原能力均随着浓度增加而呈上升趋势。由此可知,各样品总还原能力大小为：Vc>上清干粉>醇沉物。

图1 Vc对铁离子的还原能力Fig.1 Reduction ability of VC to Fe3+

图2 醇沉物对铁离子的还原能力Fig.2 Reduction ability of alcohol precipitates to Fe3+

图3 上清干粉对铁离子的还原能力Fig.3 Reduction ability of supernatant dry powder to Fe3+

2.2.2 ABTS+·清除能力 ABTS与强氧化剂反应,可以生成蓝绿色的ABTS+·,该自由基在734 nm处有最大紫外吸收。ABTS+·与抗氧化物质反应后变成无色,向一定浓度ABTS+·溶液中加入抗氧化物质,通过吸光度的减小值判断被清除自由基的多少,从而评价物质的体外抗氧化能力[22]。由图4～6及表2可知,在研究的浓度范围内,各样品对ABTS+·清除能力先随着浓度增加呈线性增强,再趋于平缓。Vc、醇沉物、上清干粉的IC50分别为12.27 μg/mL、10.8 mg/mL、1.8 mg/mL;AE值(mL/μg)分别为8.24×10-2、1.05×10-4、5.88×10-4;通过比较可知,各样品清除ABTS+·能力大小为：Vc>上清干粉>醇沉物。

图4 Vc对ABTS+·的清除能力Fig.4 The scavenging ability of Vc to ABTS+·

图5 醇沉物对ABTS+·的清除能力Fig.5 The scavenging ability of alcohol precipitates to ABTS+·

图6 上清干粉对ABTS+·的清除能力 Fig.6 The scavenging ability of supernatant dry powder to ABTS+·

表2 ABTS+·清除能力比较Table 2 Comparison of ABTS+·scavenging capacity

2.2.3 DPPH·清除能力 DPPH·是一种性质稳定的自由基,在517 nm波长下有最大吸收,常用于评价物质的体外抗氧化能力。DPPH·乙醇溶液呈紫色,在与抗氧化物质反应后变成无色物质。通过在一定浓度的DPPH溶液中加入抗氧化物质,再通过测定溶液在517 nm下吸光度大小衡量剩余自由基的量而计算出被清除的自由基的量,从而评价物质的体外抗氧化能力[23]。如图7～9及表3所示,各样品清除DPPH·能力先随着浓度增加呈线性增强,再趋于平缓。Vc、醇沉物、上清干粉的IC50分别为4.07 μg/mL、6.6 mg/mL、0.5 mg/mL;AE(mL/μg)分别为2.86×10-1、2.54×10-4、2.23×10-3,通过比较可知,各样品清除DPPH·能力大小为：Vc>上清干粉>醇沉物。

图7 Vc对DPPH·的清除能力Fig.7 The scavenging ability of Vc to DPPH·

图8 醇沉物对DPPH·的清除能力Fig.8 The scavenging ability of the alcohol precipitate to DPPH·

图9 上清干粉对DPPH·的清除能力Fig.9 The scavenging ability of the supernatant dry power to DPPH·

表3 DPPH·清除能力比较Table 3 DPPH·scavenging capacity comparison

3 结论与讨论

本研究在分析多花黄精醇沉物及醇沉上清的物质组成基础上,测定了醇沉物及醇沉上清干粉的抗氧化活性。结果表明,醇沉上清干粉中多糖、黄酮和总酚含量均高于醇沉物;且醇沉物和上清干粉的抗氧化能力有较大的差别,相同浓度的上清干粉抗氧化能力高于醇沉物;低浓度使用时,上清干粉抗氧化能力不及Vc,但随浓度增加,其还原能力及抗氧化能力逐渐增强,基本和Vc相当。

目前,多花黄精研究较多的为大分子多糖和甾体皂苷。糖类分为单糖、低聚糖、多糖及其衍生物,是中药中广泛存在的成分,但在研究多糖时由于醇沉后弃上清而得不到充分利用。黄酮类化合物是一类广泛分布于植物体内的次生代谢物,在黄精属植物中分离出了6种,研究较多的为高异黄酮类[24],其他成分有待研究。随着天然活性物质药用的逐渐兴起,植物多酚作为一种源于绿色植物的生物材料将被广泛应用于食品、药品、保健等多个领域,然而,关于黄精中总酚的研究鲜有报道。综上,无论是多花黄精醇沉物还是上清干粉中都含有黄酮和总酚,二者抗氧化活性的发挥可能与它们的协同作用有关,另外,根据醇沉物和上清干粉中多糖含量及获得的途径,其组成、结构及性质可能不同,有待进一步研究。