应用分子生物学技术检测及蛋白质模型预测1例弱D型54*

芮雪,张钰,蔡杰,许纪玲,傅强,何成涛(南京红十字血液中心,南京 210003)

Rh血型系统是人类红细胞血型系统中最复杂的系统,在输血领域的重要性仅次于ABO血型。D抗原在Rh系统中免疫原性最强且与临床密切相关,是导致新生儿溶血病、输血性溶血反应等的主要原因[1]。由于Rh系统复杂的多态性,存在多种D变异型,如弱D、不完全弱D、部分D、Del、Rhnull 和Rhmod等[2]。大部分弱D型被认为是D抗原表位基本完整而仅D抗原数量减少,但已有一些报道指出某些弱D型(Weak D3、Weak D4、Weak D15)可以导致抗D抗体的产生[3-5]。由于不同弱D型的血清学特征差异并不显著,无法通过血清学区分弱D分型。且目前多数学者仅对有临床意义的弱表型进行分子生物学研究,而忽视了对弱D型基因携带者的分子生物学机制分析。本研究对1例血型血清学检测为RhD弱阳性的样本进行分子生物学检测及家系调查分析,鉴定为弱D型54,报道如下。

1 材料与方法

1.1病历资料 采集2022年6月由南京市儿童医院河西分院送检的RhD鉴定样本。先证者(Ⅱ1),男性,5岁,江苏南京人,因疝气行术前检查,RhD血清学呈弱阳性,初步鉴定为变异型。先证者父亲(Ⅰ1)与母亲(Ⅰ2)均为RhD阳性。先证者及其父母样本均为EDTA-K2抗凝全血。

1.2试剂与仪器 D1试剂:单克隆 IgM+IgG抗-D试剂(加拿大宜美康生物制品公司),D2试剂:单克隆IgM/IgG抗-D试剂(英国Millipore公司),D3试剂:单克隆IgG抗-D试剂、D-SCREEN抗原表位检测试剂盒(法国Diagast公司),O型抗筛细胞(上海血液生物医药公司),O型谱细胞(荷兰Sanquin公司),低离子抗人球蛋白卡(瑞士Diamed公司),人类红细胞RHD血型基因分型试剂盒(天津秀鹏生物技术开发公司),DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司),PCR扩增试剂(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase,日本TaKaRa公司),Qubit dsDNA BR 分析试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)。免疫微柱孵育器(长春博研科学仪器公司),ID-Centrifuge 12 S Ⅱ型低离子抗人球蛋白卡孵育器、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司),MagNA Pure 24全自动核酸纯化仪(瑞士Roche公司),微量紫外线核酸分析仪(德国Implen GmbH公司),Veriti7500型梯度PCR仪(美国应用生物系统公司)。

1.3方法

1.3.1血型血清学检测 取样本红细胞200 μL,用0.9%生理盐水洗涤3次后,配置成0.8%和3%的2种红细胞悬液,选用3种不同细胞株的单克隆IgM抗-D和IgG抗-D试剂(D1、D2、D3)分别用于盐水试管法及抗球蛋白微柱凝胶卡法检测D抗原;用抗球蛋白微柱凝胶卡进行直接抗球蛋白试验、抗体筛查和抗体鉴定。排除直接抗人球蛋白试验和不规则抗体筛查阳性后,盐水介质中无凝集或弱凝集,而微柱凝胶卡阳性,则称为弱D试验阳性。试验均按试剂说明书操作。

1.3.2抗原表位分析 采用D-Screen试剂盒中的9种单克隆抗-D检测弱D型标本的D抗原表位,其中IgM抗-D试剂采用盐水试管法,IgG抗-D试剂采用抗球试管法检测。所有试剂均按试剂及仪器说明书操作。

1.3.3分子生物学检测

1.3.3.1PCR-SSP 取200 μL抗凝全血,按照DNA提取试剂盒说明书提取样本的基因组DNA,并使用微量紫外线核酸蛋白分析仪测定DNA浓度和纯度。DNA浓度稀释至40～60 ng/μL, DNA纯度(A260 nm/A280 nm)值为1.8～2.0。使用人类红细胞RHD血型基因分型试剂盒(PCR-SSP法)进行PCR扩增。循环参数:96 ℃ 2 min;96 ℃ 20 s,68 ℃ 60 s,5个循环;96 ℃ 20 s,65 ℃ 50 s,72 ℃ 45 s,10个循环;96 ℃ 20 s,62 ℃ 50 s,72 ℃ 45 s,18个循环; 72 ℃ 5 min,4 ℃保存。待PCR扩增结束,按照引物孔位图的顺序,将PCR产物(10 μL)转移至2.5 g/L琼脂糖凝胶孔中进行凝胶电泳10 min(150～180 V),凝胶成像仪拍照并观察结果。

1.3.3.2RHD外显子测序 将提取的DNA样本送至江苏中济万泰生物医药公司(采用3500 XL Dx基因分析仪检测,美国Applied Biosystems公司)和西安浩瑞基因技术公司(采用PacBio Sequel单分子实时测序系统)进行1～10外显子测序,测序片段为RHDexons 1～10,对序列结果进行比对和分析。RH基因序列扩增:采用PCR扩增试剂扩增基因组DNA以及使用RH基因特异性引物进行多重PCR扩增,循环参数:94 ℃ 2 min;98 ℃ 12 s,68 ℃ 12 min,27个循环;68 ℃ 10 min,获得RH基因的全长序列。PCR产物进行浓度(采用Qubit dsDNA BR 分析试剂盒分析)和琼脂糖凝胶电泳质检,合格后使用Sequel Ⅱ Sequencing Plate 2.0软件(PacBio公司)进行测序分析。

1.3.3.3AlphaFold建模模拟蛋白质表达 将已经获取的蛋白质序列fasta文件格式下载,然后提交至超算中心进行Aphafold建模,建模完成后,产生模型。构建的模型经过多次优化完成后,需要对其结构进行评估。拉氏图评价方法用以表明蛋白质中氨基酸的允许和不允许构象。主链构型中的φ,ψ二面角可从拉氏图中读出,当不低于 90%的φ,ψ二面角分布在允许区的时候则表明模型合理。使用Alphafold 在线结构数据库(https://github.com/deepmind/alphafold)预测蛋白质中每对氨基酸之间的距离分布,以及连接它们的化学键之间的角度,从而构建蛋白质的三级结构。

2 结果

2.1血型血清学结果 先证者RhD初筛结果为盐水弱凝集(1+),IAT 凝集强度显示4+。Rh系统其他抗原表型为Ccee。父亲(Ⅰ1)和母亲(Ⅰ2)RhD初筛结果为阳性,Rh系统其他抗原表型分别为CcEe和Ccee;所有样本直接抗人球蛋白试验、抗筛试验及抗体鉴定试验均为阴性。血型血清学检测结果见表1。

表1 各样本血型血清学检测结果

2.2D抗原表位分析结果 D抗原表位检测结果见表2。先证者红细胞与epD8.2抗体无凝集反应,与其他抗原表位反应呈弱凝集。其父母的红细胞与针对D抗原的epD6.6、epD6.4、epD5.4、epD8.2、epD9.1、epD2.1和epD3.1表位的单克隆抗-D反应呈强阳性(3+～4+)。

表2 D抗原表位反应格局

2.3RHD基因初分型结果 先证者(Ⅱ1)及其父亲(Ⅰ1)、母亲(Ⅰ2)RHD基因初分型结果见图1。

注:1泳道对应外显子1特异性检测,分子量大小为132 bp;2泳道对应外显子5特异性检测,分子量大小为157 bp;3泳道对应外显子6特异性检测,分子量大小为132 bp;4泳道对应外显子7特异性检测,分子量大小为287 bp;5、6泳道分别对应845A和845G位点特异性检测,分子量大小为188 bp;7～8泳道显示1227A和1227G的特异性检测,分子量大小为348 bp和201 bp。图1 PCR-SSP电泳检测结果

2.4基因测序结果 Sanger测序结果显示先证者外显子3的365位存在C>T纯合错义突变(图2B),其他序列与正常RHD基因一致。其父亲外显子3的365位存在C>T的杂合错义突变(图2 A),其他序列与正常RHD基因一致。SMRT单倍型测序结果显示其母亲检测出1条完整的RHD基因序列,而另外1条染色体上发生了RHD基因的全缺失(图2 C)。

注:由于Sanger测序无法分开测定两条染色体的基因型,无法确定样本Ⅰ2的隐性基因型,故对进行SMRT单倍型测序分析。图2 样本Ⅰ1和Ⅱ1的RHD外显子测序结果

2.5先证者的家系结果 家系调查显示先证者父亲(Ⅰ1)基因型为RHD*01/RHD*weak D type 54;先证者母亲(Ⅰ2)基因型为RHD*01/RHD*01N.01。先证者(Ⅱ 1)RHD基因第3外显子第122位碱基 C>T突变遗传自其父亲,RHD基因全缺失的染色体遗传自其母亲,其基因型为RHD*weak D type 54/RHD*01N.01。见图3。

注:空白区域表示D阳性基因,阴影区域表示D阴性基因,斜线区域表示弱D54基因。图3 该家系图谱

2.6AlphaFold模拟蛋白质结构 由Aphafold构建出先证者的RhD抗原突变前后的蛋白质三级结构模型,见图4。突变后,丝氨酸变为亮氨酸,且无法再与GLU146位形成氢键,进而导致蛋白质三级结构发生改变。

注:野生型RHD蛋白质结构骨架中N原子与MET118形成氢键,骨架中O原子与蛋白SER126形成两根氢键,丝氨酸的酚羟基与蛋白GLU146形成氢键,其氢键的距离为3.0、3.2、3.1和3.3Å。图4 突变前后蛋白质三级结构内部的改变

3 讨论

Rh抗原受RHD、RHCE、RHAG基因调控,RhD和RhCE蛋白仅有33个氨基酸的差异,而位于细胞膜外的氨基酸仅有7个不同[4]。因RHD和RHCE基因的高度相似性,常会发生编码基因的交换和融合,使表达的蛋白质缺乏某些抗原表位,影响血型鉴定[6-8]。本研究中样本Ⅱ1 RhD血清学结果初筛为弱阳性(1+),父母均为阳性。D-screen抗原表位分析发现样本Ⅱ 1与D抗原的其他8种表位呈弱凝集反应,而与epD8.2无凝集反应(表2)。推测此样本不仅D抗原数量减少,还有部分表位缺失。

笔者利用PCR-SSP方法对其家系成员进行RHD基因分型,结果均为RHD基因阳性。由于基因分型结果与血清学结果不一致,对其家系成员进行RHD基因1～10外显子测序。笔者发现Ⅰ1为弱D54等位基因携带者且有杂合峰,而Ⅱ1基因型为弱D型54,在RHD基因测序时均未见杂合峰,推测其仅有1条RHD基因。进一步通过三代测序对Ⅰ2的RHD基因分型显示其存在1条RHD基因,另外1条缺失,家系调查结果符合遗传规律。

RhD蛋白的抗原性除了与氨基酸序列相关外,还取决于其复杂的空间构象[4]。通过AlphaFold进行三维建模,提示野生型蛋白质三级结构中第122位是极性不带电的丝氨酸,RHD基因第365位碱基发生C>T突变,使第122位氨基酸由丝氨酸转变为亮氨酸,大而非极性带电的亮氨酸并不能与GLU146形成氢键相互作用。这些氨基酸的分子间相互作用力减弱后,可能会导致RhD蛋白与膜的结合受阻,引起D抗原数量的减少。

目前国际输血协会数据库中已列出约163种弱D表型(http://www.isbtweb.org/working-parties/red-cellimmunogenetics-and-blood-groug-terminolter),其中弱D1型、D2型、D3型、D4型约占弱D表型的95%[6],通常不会引起同种免疫反应[9]。南京地区发现的血清学弱D表型经分子生物学鉴定大多数是弱D型15[10],而弱D型 54目前仅在上海、辽宁及山东地区进行RHD阴性献血者的基因分析时发现并报道过5例[9-13]。RHD*weak D type 54等位基因(c.365C>T,p. Ser122Leu)于2006年在GenBank发布(登记号:AM396583),随后被 ISBT 命名。叶璐夷等[11]研究指出Rh其他分型为Ccee的弱D型54型具有部分D表型的特性,可能引起同种免疫反应。弱D免疫原性不强,一般不能使Rh阴性受血者产生抗-D,但其反应性强,可被血浆中的抗-D快速破坏,引起严重溶血性输血反应[14]。因此,血清学弱D表型的献血者应作为D抗原阳性对待,而受血者应视为RhD阴性[15],需要对RhD变异型进行分子生物学检测。

在实际工作中,大型医院的临床标本量很多,几乎都采用全自动血型仪进行术前血型鉴定(微柱凝胶法),如果没有用盐水法复核可能会造成漏检。此外,虽然可用不同的克隆株鉴定30种D抗原表位[16],但仍有一些罕见的变异型无法检出。临床可用分子生物学技术进行鉴定,结合Alphafold预测突变后的蛋白质结构,有助于探讨D变异型的分子机制,揭示中国人群RHD基因的多态性,实现精准输血。另一方面,传统方法在罕见的RH血型中不容易分析,而三代测序可以将可能存在的重组形式清晰地分析出来,可以将之前无法准确判断的情况在新方法下明确出来。目前三代靶向测序的成本进一步降低,也有利于未来临床的广泛应用。当然,本研究也存在不足之处,如没有阐明弱D型 54中可能的部分D型的分子机制,缺乏对溶血程度的统计分析,有待于对同样表型的样本进行系统性研究。