子宫内膜癌中LncRNA FAM 83H-AS1的表达以及与患者临床病理特征和预后的关系

宋晓霞 ,刘玉玲 ,张琦

1郑州人民医院 妇产科,郑州 450053;2 郑州大学第二附属医院 妇产科,郑州 450000;3 重庆市长寿区妇幼保健院,重庆401200

子宫内膜癌(Endometrial Cancer,EC)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,我国子宫内膜癌的发病率位居女性恶性肿瘤的第二位,随着我国人口老龄化的加剧,其发病率和死亡率均呈逐年上升趋势[1-2]。目前,子宫内膜癌的发病和转移机制尚不清楚。长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一类长度大于200个核苷酸,不编码蛋白质的功能性RNA 分子[3-4]。虽然LncRNA 不具有编码蛋白质的功能,但能够通过调节m RNA 剪切、降解和翻译等生理过程发挥作用[5]。序列相似性家族83成员H 反义RNA 1(FAM83H-AS1)是一种与癌症进展密切相关的Lnc RNA,其异常的高表达水平与多种癌症的发生发展密切相关。目前还没有FAM83H-AS1在子宫内膜癌中的作用及其机制相关研究,FAM83 H-AS1对子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用仍不清楚。本研究主要通过检测人子宫内膜癌组织及癌旁组织中LncRNAFAM83HAS1的表达水平,并通过细胞学实验验证LncRNAFAM83H-AS1对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和转移的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料

本研究搜集2018年10月至2020年10月就诊于郑州人民医院的39例子宫内膜癌患者的肿瘤组织以及配对的癌旁组织,其中包括子宫内膜样癌20例(其中G1 5例,G2 7例,G3 8例),非内膜样癌19例(其中包括浆液性癌10例,粘液性癌5例,透明细胞癌4例)。组织标本于手术期间取得,并立即在-80 ℃下冷冻直到下一步使用。在实验样本收集之前,从每个参与者处获得了书面知情同意,研究方案经郑州人民医院临床研究伦理委员会批准备案。

纳入标准:①年龄25～75岁;②符合《妇产科常见疾病指南》[5]中子宫内膜癌诊断标准;③经病理组织学检查确诊者;④入院前3个月无性激素类药物治疗史者;⑤术前未接受过放疗、化疗等抗肿瘤治疗方案者;⑥依从性良好。

排除标准:①脑外伤、中枢神经系统感染引起的痴呆等;②精神疾病患者;③酗酒或药物滥用史患者;④心肝肾严重功能障碍患者;⑤合并其他肿瘤性疾病者;⑥血液性系统疾病患者。

4种子宫内膜癌细胞系(HEC-1B,HEC-1A,ishikawa以及RL-952)和1株正常子宫内膜上皮细胞系(hEEC)购自湖南丰晖生物科技有限公司(湖南)。

1.2 主要方法

1.2.1 qRT-PCR

采用qRT-PCR 分析了在临床上收集的39 例子宫内膜癌患者的肿瘤组织以及配对的癌旁组织中FAM83H-AS1的表达水平。具体步骤:通过TRIzol试剂(Thermofisher scientific,USA)提取,并且使用NanoDrop 1 000 分光光度计(Thermofisher scientific,USA)测定蛋白质浓度。使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies)评估提取的RNA 的质量,使用PrimeScript synthesis cDNA kit(Takara Biotechnology,Japan)反转录合成cDNA,SYBR Green PCR Master Mix(Takara Biotechnology,Japan)进行qPCR,将GAPDH mRNA含量标准化。引物序列如下:FAM83H-AS1:(R)5′-AGCTCCACCTCCCGGGTTCACG-3′(F)5′-CGTGAACCCGGGAGGTGGAGCT3′。逆转录反应体系按照说明书严格进行。

1.2.2 构建低表达FAM83H-AS1的子宫内膜癌细胞系

靶向FAM83H-AS1的shRNA 由生工生物科技有限公司(Sangon Biotech,Shanghai,China)合成,并插入p LKO.1-TRC克隆载体(Addgene)中,靶向序列分别为:′-CTTGCGATCGGGTCGATCGATCTTAGCTTTGCGA-3′ (shRNA1) 和 5′-GTCCGTAGCTAGCTAAAGTCGATTCGATCGTACAAGA -3′(shRNA-2)。另外将p LKO.1-TRC对照载体用作对照的空载体(命名为Scr-shRNA)。

1.2.3 细胞增殖实验(CCK-8法)

转染后24 h收集细胞并进行重悬,将细胞密度为1×106个/m L,浓度为2×105个/m L 的单细胞悬液接种到96孔板中,并在细胞接种后96 h进行细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定(Beyotime,China)。96 h后取出孔板,将10μLCCK-8溶液添加到每个孔中并在37℃下孵育2 h后,使用酶标仪(Bio-Rad Laboratories,USA)在450 nm 的波长下分析细胞的增殖活性。将来自三个独立实验的结果取平均值进行分析。

1.2.4 TUNEL染色

首先用PBS或HBSS洗涤一次。如果细胞贴得不牢,可以干燥样品使细胞贴得更牢;用4%多聚甲醛固定细胞30 min;用PBS或HBSS洗涤一次;加入含0.3% Triton X-100 的PBS,室温孵育5 min;在样品上加50μL TUNEL检测液,37 ℃避光孵育60 min;PBS或HBSS洗涤3次。最后用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500 nm,发射波长范围为515-565 nm。

1.2.5 Ed U 染色

显微镜下观察细胞,配制2×Ed U 工作液,加入2×Ed U 工作液,孵育-固定-弃去培养液,用4%多聚甲醛溶液来固定,固定时间20 min。洗涤-渗透剂-洗涤,Ed U 检测。

1.2.6 流式细胞术

使用胰酶消化细胞,1 000 rpm 离心收集所有细胞;使用4 ℃预冷的PBS 洗涤细胞2 次;用0.5 mL PBS悬浮细胞,缓慢加入到预冷的70%乙醇溶液中(用PBS配制,-20℃预冷),快速混匀,使用封口膜封口,-20℃固定过夜;将固定过的细胞以4℃,1 000 rpm,离心5 min,弃上清液,转移到EP管中,用PBS洗涤2次。计数细胞,调整细胞密度为1×106 个细胞/mL,取1mL进行试验。4 ℃,1 000 rpm,离心5 min 取细胞沉淀;加入900μL PBS 缓冲液重悬细胞;加入100 μL RNaseA 溶液,使RNaseA 终浓度为100μg/mL),37℃孵育30min;4℃,1 000 rpmin离心5 min,弃去上清液;加入450μL PBS 悬浮细胞,加入450μL PI染液,避光冰置20 min;上流式细胞仪检测,分析记录结果。

1.2.7 Transwell实验

采用了Transwell实验分析了HEC-1A 和HEC-1B细胞的迁移和侵袭能力的改变。Matrigel胶4℃过夜,提前开制冰机,枪盒预冷。Matrigel胶的原液为8.6 mg/mL。用无血清培养基将Matrigel胶分别配制成100μg/mL和30μg/m L的溶液;向24孔板的每孔中加入400μL体积、浓度为30 mg/mL的Matrigel胶溶液,将transwell小室置于溶液内,再滴加200μL浓度为30 mg/mL的Matrigel胶溶液,冰上放置1 h后吸弃溶液、晾干;将100 ng/mL的Matrigel胶溶液吹打均匀后,吸取100 uL缓慢滴加于transwell上室基底膜上。晃动均匀后置于37℃培养箱内放置0.5 h;将细胞在无血清培养基中培养过夜;将小室放入含有600μL无血清培养基的24孔板小孔中后,放置孵育箱活化30 min以上;消化细胞,将其制成单细胞悬液,吸取1 mL至标记好的1.5 mL EP管内,离心后用无血清培养基重悬细胞。调整细胞浓度为2×105个/mL的单细胞悬液;取200μL细胞悬液加入到小室上室中,在小室的下室中加入600μL含15%FBS的RPMI-1640培养基,放于孵育箱中培养24 h;弃培养基,用含4%多聚甲醛的固定液室温固定细胞20 min,接着用0.1%结晶紫染色20 min,然后用棉签擦去小室上层细胞,冲洗晾干小室;于倒置显微镜下采集图像(100×),随机选取6个不同视野计数分析。

1.3 数据分析方法

对实验数据的分析使用GraphPad Prism 8.0软件,对于临床样本分析,使用paired-t-test检测数据间的显著性差异,对于细胞实验,使用one-Way ANOVA 或者Two-Way ANOVA 方差分析,方差分析之后使用Tukey's multiple comparison test进行独立检验,P<0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 LncRNA FAM 83H-AS1在子宫内膜癌组织中的表达水平明显增高

LncRNAFAM83H-AS1在癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织(图1)。为了进一步分析FAM83H-AS1的表达水平与患者的临床表型的相关性,研究分析了FAM83H-AS1的表达水平与患者的年龄、肿瘤大小、FIGO 分期、淋巴结转移、肿瘤组织学分级以及组织学类型的关系,结果发现FAM83H-AS1的表达水平与患者的年龄、肿瘤大小无明显的相关性(P>0.05)。但是,在FAM83 HAS1阳性的患者中,具有更高的FIGO 分期,此外,研究还发现,非内膜样癌FAM83 H-AS1的表达水平更高,且肿瘤的组织学分级越高,就更具有转移的可能,预示着预后情况更为不佳。见表1。

表1 子宫内膜癌肿瘤组织中FAM 83H-AS1的表达水平与子宫内膜癌临床病理特征相关性

图1 FAM 83H-AS1在子宫内膜癌组织中的表达水平明显提高

2.2 低表达FAM 83H-AS1的子宫内膜癌细胞系构建成功

为了验证FAM83H-AS1在子宫内膜癌中的作用,我们首先采用sh RNA 靶向FAM83H-AS1 转染至子宫内膜癌细胞HEC-1A 和HEC-1B细胞中,通过qRT-PCR 检测细胞中FAM83 H-AS1的表达水平用于确认敲低效率,发现sh RNA-1与sh RNA-2均具有良好的敲低效应,并且sh RNA-1的效率更高,见图2。

图2 shRNA对FAM 83H-AS1敲低效率的检测

2.3 敲低FAM 83H-AS1削弱子宫内膜癌细胞的增殖活性

采用CCK-8试剂盒分析在敲低FAM83H-AS1之后,检测HEC-1A 和HEC-1B 细胞的增殖活性。结果显示,在敲低FAM83 H-AS1的子宫内膜癌细胞HEC-1A 和HEC-1B 细胞中,在24 h后细胞活性显著低于转染Scr-sh RNA 的细胞(图3A),进一步将子宫内膜癌细胞系HEC-1A 和HEC-1B 接种在琼脂糖凝胶平皿中,用于分析细胞的克隆形成数量,接种后7天,对平板进行结晶紫染色,研究结果显示敲低FAM83 H-AS1的子宫内膜癌细胞HEC-1A 和HEC-1B细胞在平板中形成的细胞克隆数量显著减少(图3B)。并且,我们采用Ed U 染色检测细胞中的增殖细胞数量,我们发现Ed U 阳性细胞数量明显减少(图3C)。

图3 敲低FAM 83H-AS1削弱子宫内膜癌细胞的增殖活性

2.4 敲低FAM 83H-AS1促进子宫内膜癌细胞的凋亡

而后,采用TUNEL 染色检测了在敲低FAM83 H-AS1 的子宫内膜癌细胞HEC-1A 和HEC-1B细胞的凋亡小体的形成数量,观察到在sh-NC的细胞中,平均每个视野有2～3个绿色荧光基团(凋亡小体),然而在敲低FAM83 H-AS1的子宫内膜癌细胞中,平均每个视野的凋亡小体数量明显增加(图4A)。并且,我们进一步采用流式细胞术检测细胞中的凋亡比例,我们观察到敲低FAM83HAS1会显著促进的细胞凋亡(图4B)。以上结果均充分说明敲低FAM83H-AS1会导致子宫内膜癌细胞的活性降低,并且促进细胞的凋亡。

图4 敲低FAM 83H-AS1促进子宫内膜癌细胞的凋亡

3 讨论

在人类基因组中大约只有2%的基因编码蛋白质;大多数基因组不会翻译成蛋白质,而是可以编码一系列非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)[6]。在最近的几十年中,已经鉴出了一组称为长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)的非编码RNA。大多数LncRNA通常位于细胞核中,在那里它们可能在表观遗传调控中起关键作用,包括通过染色质修饰,但是,越来越多的研究已经确定了细胞质中也存在LncRNA。这表明LncRNA在基因的表达、翻译以及翻译后调控中都起到重要作用[7]。研究表明,具有序列相似性的83位成员H 反义RNA 1(FAM83H-AS1)LncRNA家族的异常表达与癌症患者的预后不良有关。在之前Ma等[8]的研究结果中发现,肝癌患者中高表达的FAM83H-AS1与总生存期(Overall Survival,OS)具有明显相关性。在胃癌中,FAM83H-AS1高表达能够影响胃癌患者的OS和无病生存率(Diseas-Free Survival,DFS),FAM83H-AS1在胃癌的发生发展中扮演者癌基因的作用[4]。另一项研究[9]表明,卵巢癌患者肿瘤组织中FAM83H-AS1的表达水平明显高于癌旁组织,并且高表达FAM83H-AS1与卵巢癌的肿瘤分化程度,与肿瘤淋巴结转移和远处转移有关。

本实验中,主要采用了qRT-PCR检测了在临床收集的39例子宫内膜癌患者的肿瘤组织及其配对的癌旁组织中FAM83H-AS1的差异表达情况,为了进一步分析FAM83H-AS1的表达水平与患者的临床表型的相关性,研究分析了FAM83H-AS1的表达水平与患者的年龄、肿瘤大小、FIGO 分期、淋巴结转移、肿瘤分化程度以及组织学类型的关系,结果发现FAM83H-AS1的表达水平与患者的年龄、肿瘤大小无明显的相关性(P>0.05)。但是,在高表达FAM83H-AS1的患者中,具有更高的FIGO分期,此外,研究还发现,非内膜样癌FAM83H-AS1的表达水平更高,且肿瘤的组织学分级更高,就更具有转移的可能,预示着预后情况更为不佳。进一步使用Lipofectamine2000转染试剂盒将靶向FAM83H-AS1的shRNA质粒转染至子宫内膜癌细胞HEC-1A和HEC-1B细胞中,通过qRT-PCR检测shRNA的转染效率。随后的实验发现敲低FAM83H-AS1会显著抑制子宫内膜癌细胞在体外的增殖,其主要表现在低表达FAM83H-AS1HEC-1A和HEC-1B的子宫内膜癌细胞的增殖活性被显著抑制,在平板上形成的克隆数量也显著减少。而且,进一步通过TUNEL染色发现,敲低FAM83H-AS1会显著促进HEC-1A 与HEC-1B细胞中的凋亡小体的形成,从而揭示了低表达FAM83H-AS1会明显促进子宫内膜癌细胞的凋亡。

以上结果说明,LncRNAFAM83H-AS1高表达可能与子宫内膜癌的发生发展有关,并可能与促进癌细胞的转移有关。但是由于样本数量较少,LncRNAFAM83H-AS1在子宫内膜癌发病机制中的作用以及表达与调控机制有待于进一步研究,此外,该基因是否可作为子宫内膜癌患者的易感筛查指标,以及如何找到有效下调LncRNAFAM83H-AS1的方法,是我们下一步研究的目标。