枳漆酶基因家族鉴定及其响应盐胁迫的表达分析

徐小勇 顾铭洲 梁梦鸽 姜丽娟

摘要：漆酶（LAC）是植物木质素生物合成中催化木质素单体聚合的关键酶，在调控植物生长发育和胁迫响应中发挥着重要作用。对枳漆酶基因家族进行鉴定和分析，并探究其在盐胁迫下的表达模式，可为进一步研究枳漆酶基因功能提供重要的参考信息。采用生物信息学手段鉴定枳漆酶基因家族成员，对其家族成员的理化性质、基因结构、系统进化关系、启动子顺式作用元件等进行分析，并通过qRT-PCR方法分析其盐胁迫表达模式。结果表明，枳基因组中共有20个LAC基因家族成员，其中18个分布在5条已知染色体上，2个分布在未知染色体上，被预测定位到细胞膜和细胞核中；共有6～14个外显子，5～13个内含子，9～11个motif；系统进化树分析结果显示，20个枳LAC基因家族成员与17个拟南芥LAC基因家族成员共分成7个亚组，20个枳LAC基因家族成员分布在其中的6组；20个枳LAC基因家族成员与拟南芥LAC基因间存在19对共线性关系；启动子区域含有24种顺式作用元件，其中厌氧诱导元件、干旱响应元件和茉莉酸甲酯响应元件数量最多；16个枳LAC基因在盐胁迫下显著上调表达，推测枳漆酶基因参与了盐胁迫响应。

关键词：枳；漆酶基因；进化树；顺式作用元件；盐胁迫

中图分类号：S188+.3  文献标志码：A  文章编号：1002-1302（2023）09-0052-08

基金项目：国家重点研发计划（编号：2018YFD1000107）；江苏省农业科技自主创新资金［编号：CX（21）3024］。

作者简介：徐小勇（1979—），男，江西奉新人，博士，副教授，主要从事果树生物技术研究。E-mail：xyxu@yzu.edu.cn。

漆酶（Laccase，LAC，EC 1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，可催化酚类等多种底物的氧化，并将氧气还原成水［1］。漆酶最早在1883年由日本学者Yoshida从漆树的漆液中发现［2］，之后在细菌、真菌、昆虫和其他植物中陆续发现［3］。已有研究发现，漆酶参与植物细胞壁木质素生物合成途径的最后阶段，即木质素单体的聚合［4］。因此，漆酶在植物生长发育、生物和非生物胁迫响应中具有重要的调控作用［4］。

漆酶由多基因编码，随着众多植物基因组数据的公布，不少物种已经完成了漆酶基因家族的鉴定。例如，在模式植物拟南芥中，17个漆酶基因被鉴定出来，其中AtLAC4、AtLAC11和AtLAC17与木质素合成有关［5-6］；在水稻（Oryza sativa）基因组中，共有30个LAC［7］；在柳枝稷草（Panicum virgatum）中共鉴定出49个LAC［8］；在梨（Pyrus bretschneideri）中共鉴定出40个LAC［9］；在茶树（Camellia sinensis）中共鉴定出43个LAC［10］；在荔枝（Litchi chinensi）中共鉴定出61个LAC［11］；在桃（Prunus persica）、茄（Solanum melongena）中皆鉴定出48个LAC［12-13］。值得注意的是，漆酶基因在逆境胁迫中的作用正获得越来越多的关注。一般而言，漆酶基因在胁迫下会富集表达，特别是在盐胁迫条件下。例如，玉米ZmLAC1、拟南芥AtLAC2、水稻OsChI1和胡萝卜DcLAC1在盐胁迫下都显著上调表达，而过表达漆酶基因能提高植物的耐盐性［14-17］。

柑橘是世界第一大果树，也是我国栽培面积最大、经济价值较高的果树。然而柑橘以露地栽培为主且对环境条件要求较高，易受多种生物、非生物逆境胁迫的影响，极大程度地限制了我国柑橘产业的良性健康发展。因此，亟待开展柑橘抗逆基因挖掘与鉴定研究［18-21］。枳是芸香科枳属小乔木，具有抗寒、抗旱、适应性强等优点，是我国目前应用最多、最广的柑橘砧木。本研究根据已公布的枳基因組数据［22］，采用生物信息学手段鉴定枳漆酶基因家族成员，分析其理化特征、基因结构、系统进化关系、启动子顺式作用元件和盐胁迫表达模式，以期挖掘与盐胁迫响应相关的漆酶基因，为枳LAC基因功能研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

本试验于2022年3月在扬州大学园艺园林学院实验室内完成。

1.2 枳漆酶基因家族的鉴定

枳（Poncirus trifoliata L.）基因组序列、蛋白质序列及其注释信息均下载自CPBD数据库（http：//citrus.hzau.edu.cn/）。从植物参考基因组数据库Ensembl（http：//plants.ensembl.org）中下载拟南芥的基因组相关数据（基因组序列和注释信息）。

以拟南芥的17个LAC蛋白序列作为查询序列，设置检索阈值（E-value）为10-5，通过TBtools软件的BLAST功能搜索枳蛋白数据库，获得候选枳LAC蛋白序列，通过NCBI、SMART数据库（http：//smart.embl-heidelberg.de/）进行蛋白保守结构域的鉴定。通过在线工具Expasy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）对枳LAC基因家族成员进行蛋白质理化性质预测。使用在线软件Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）对枳LAC蛋白家族进行亚细胞定位预测。

1.3 枳LAC基因家族基因结构和motif 分析

通过在线工具MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）进行motif分析，motif数目设置为10个，其他均为默认值，利用TBtools软件对基因结构和motif数据进行可视化作图。

1.4 枳和拟南芥LAC基因家族的系统进化树分析

使用枳、拟南芥的LAC蛋白序列，用Mega X进行多序列比对，并用最大似然法（Maximum likelihood，ML）构建系统进化树，Bootstrap参数设置为1 000，其他参数选择默认值。用Evolview在线软件对系统发生树进行编辑和美化。

1.5 枳和拟南芥LAC基因家族的共线性分析

用MCScanX 程序对枳、拟南芥的基因组信息进行比对，并通过TBtools软件的Multiple SystenyPlot工具分析其共线性关系。

1.6 枳LAC基因启动子顺式作用元件分析

选取枳LAC基因转录起点上游2 000 bp的序列作为启动子区域，利用在线工具PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）获得每个枳LAC基因启动子区域中所有的顺式作用元件，并筛选出重要的响应元件，进行统计分析。

1.7 植物材料和盐胁迫处理

选择发育一致的45日龄枳幼苗，将幼苗在含有300 mmol/L氯化钠的溶液中进行盐胁迫处理，处理后0～5 d采收根系。所有样本直接收集到液氮中，于-80 ℃保存，直至提取RNA。每个试验设3个生物学重复，每个重复采5株幼苗样品。

1.8 RNA提取和qRT-PCR检测

采用乙二胺四乙酸（EDTA）法提取总RNA，用凝胶电泳和生物分析仪检测RNA质量，用TransScript逆转录酶（TaKaRa公司产品），具体操作参照制造商的说明书。qRT-PCR的基因特异性引物序列见表1。以2 μL cDNA為模板，用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Plus （2×）（TaKaRa公司产品）进行25 μL PCR反应，每个引物浓度为10 μmol/L。采用CFX96实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD）进行qRT-PCR检测，以柑橘β肌动蛋白基因（ACTB）为内控基因。反应过程如下：95 ℃预变性 3 min；95 ℃延伸时间30 s，根据特定引物设置的退火温度（T）下退火30 s，共40个循环。聚合酶链式反应结束后，于65～95 ℃进行熔化曲线分析。所有qRT-PCR分析重复3次。采用2ΔΔCT法评估基因的表达水平。

2 结果与分析

2.1 LAC基因家族成员鉴定及其对应蛋白的理化性质预测

通过BLAST和保守结构域鉴定方法，共在枳基因组中发现20个LAC基因成员（表2），根据其在染色体的分布将其命名为PtrLAC1～PtrLAC20（图1）。其中，PtrLAC1位于3号染色体上，PtrLAC2、PtrLAC3位于4号染色体上，PtrLAC4、PtrLAC5位于5号染色体上，PtrLAC6～PtrLAC13位于6号染色体上，PtrLAC14～PtrLAC18位于8号染色体上，PtrLAC19、PtrLAC20位于未知染色体上。枳LAC基因编码的氨基酸长度介于553～1 112之间，相对分子量介于60.55～120.82之间，等电点介于5.02～9.88之间，亲水性介于-0.247～0.000之间。此外，枳LAC蛋白的不稳定系数位于26.00～38.14范围，都低于40.00，表明这20个LAC基因成员都是稳定的。用在线软件Plant-mPLoc进行亚细胞定位预测，结果显示，所有枳LAC蛋白都位于细胞膜上，此外，发现PtrLAC7位于细胞核上。这揭示枳LAC蛋白可能参与细胞壁的木质素合成。

2.2 枳PtrLAC基因结构和motif分析

如图2所示，枳LAC基因共有6～14个外显子、5～13个内含子。总体而言，基因之间的基因结构差异较小，多数为6个外显子、5个内含子。基因结构比较特殊的基因为PtrLAC7、PtrLAC13，有较多外显子、内含子。Motif分析发现，枳LAC蛋白含有 9～11个motif。除PtrLAC7、PtrLAC13外，所有枳LAC蛋白具有相同Motif。有趣的是，PtrLAC13缺失motif 2，而PtrLAC7相较于其他枳LAC基因家族成员多1个motif 8。

2.3 系统进化树及共线性分析

为了探究枳PtrLAC基因与模式植物拟南芥的进化关系，构建它们的系统进化树（图3）。根据进化树的结果，将其分为7个亚组。PtrLAC10、PtrLAC11、PtrLAC12、PtrLAC14、PtrLAC15、PtrLAC16、PtrLAC19和PtrLAC20在第1组；PtrLAC3、PtrLAC6、PtrLAC13和PtrLAC17在第2组；PtrLAC1在第4组；PtrLAC7、PtrLAC8和PtrLAC9在第5组；PtrLAC4在第6组；PtrLAC2、PtrLAC5和PtrLAC18在第7组。上述结果表明，枳LAC基因家族可能存在功能多样性。共线性分析结果显示，枳和拟南芥LAC基因间存在19对共线性关系（图4），暗示这些LAC基因对可能来自共同的祖先，具有相似的功能。

2.4 启动子区域顺式作用元件分析

顺式作用元件分析结果表明，枳LAC基因启动子区域共有24种顺式作用元件，包括生长发育元件、激素响应元件和逆境响应元件三大类型（图5）。其中逆境响应元件类型最多，共有11个。生长发育元件主要有分生组织特异性元件（CAT-box，70% LAC成员）和玉米醇溶蛋白代谢调控元件（O2-site，35% LAC成员）。激素响应元件主要有茉莉酸甲酯响应元件（CGTCA-motif或TGACG-motif，90% LAC成员）、脱落酸响应元件（ABRE，80% LAC成员）和生长素响应元件（AuxRR-core，50% LAC成员），表明枳LAC基因可能受到多种激素的调控表达。逆境响应元件主要有厌氧诱导元件（ARE，所有LAC成员）、干旱响应元件（MBS，90% LAC成员）和低温响应元件（LTR，50% LAC成员），暗示枳LAC基因可能响应多种逆境胁迫。

2.5 鹽胁迫处理对枳LAC基因表达的影响

已有研究发现，多种植物的LAC基因在盐胁迫下诱导表达［14-17］。因此，本研究采用qRT-PCR方法分析所有枳LAC基因在盐胁迫处理下的表达模式。如图6所示，盐胁迫处理使得80%的枳LAC基因在不同时间点显著上调表达，其中多数集中在处理后第1天（PtrLAC3、PtrLAC5、PtrLAC6、PtrLAC10、PtrLAC11、PtrLAC13、PtrLAC15和PtrLAC18）和第5天（PtrLAC1、PtrLAC4、PtrLAC9、PtrLAC14和PtrLAC19），仅PtrLAC2、PtrLAC7、PtrLAC12、PtrLAC17的相对表达量出现下调。值得注意的是，PtrLAC9的相对表达量在处理5 d时急剧升高（约为初始值的47倍）。由此推测，PtrLAC9基因是盐胁迫响应的关键LAC基因之一。

3 讨论与结论

植物漆酶参与木质素单体的聚合，从而影响木质素合成和组分，在植物的生长和发育、应答生物或非生物胁迫反应中具有重要调控作用。迄今，尚未见关于枳漆酶基因家族的研究报道。本研究通过生物信息学方法在枳中共鉴定出20个LAC基因（PtrLAC1～PtrLAC20）。但对多数植物而言，枳LAC基因成员的数目较少［7-13］。枳LAC基因在染色体上的分布不均匀，较集中在第6号、8号染色体上，与甜橙LAC基因的染色体定位一致［23］；共有6～14个外显子、9～11个motif，主要定位在细胞膜上，这些特征在不同物种之间的差异较大［7-13，23］。值得注意的是，PtrLAC7定位到细胞膜和细胞核上，且多1个motif 8，暗示该基因可能具有特殊功能。

在本研究中，枳LAC基因启动子区域的顺式作用元件分析结果显示，其启动子区域含有24种顺式作用元件，包括生长发育元件、激素响应元件和逆境响应元件，暗示着枳LAC基因可能受到多种植物激素和环境逆境诱导 并参与植物生长发育过程调

控。对于不同植物而言，LAC基因启动子区域的顺式作用元件在数量、种类上具有一定差异，尤其是富集的顺式作用元件种类［8，10，24］。例如，茶树LAC基因主要富集厌氧诱导响应元件、茉莉酸甲酯和乙烯响应元件［10］；多数柳枝稷草LAC基因存在脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件和干旱响应元件［8］；枳LAC基因富含干旱响应元件、厌氧诱导响应元件和茉莉酸甲酯响应元件。但上述预测的顺式作用元件有待通过试验验证。

系统进化树分析将20个枳LAC基因家族成员与17个拟南芥LAC基因家族成员分成7个亚组，与前人的研究结果［9，23］一致。同一亚组的枳LAC基因与拟南芥LAC基因可能具有相同或相似的功能。考虑到AtLAC4、AtLAC11和AtLAC17与木质素合成有关，笔者推测PtrLAC6和PtrLAC17（与AtLAC4聚类）、PtrLAC13（与AtLAC11聚类）及PtrLAC14和PtrLAC15（与AtLAC17聚类）参与枳木质素生物合成。此外，AtLAC7、AtLAC8和AtLAC9这3个基因在缺铁、创伤或盐胁迫下上调表达［25］。因此，我们预测同一亚组下的PtrLAC7、PtrLAC8和PtrLAC9可能与胁迫响应相关。本研究的qRT-PCR分析结果显示，PtrLAC8、PtrLAC9在盐胁迫下显著上调表达，而PtrLAC7显著下调表达，可见这3个基因确实与盐胁迫响应相关，但它们是否参与枳盐胁迫响应调控尚不清楚。目前笔者所在本课题组正在进行PtrLAC9的功能鉴定研究，有望进一步揭示其功能。

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