大麻二酚高产因素研究进展

张元野，张利国，张明，房郁妍，郑楠，闫博巍，隋月

(黑龙江省农业科学院经济作物研究所，黑龙江哈尔滨 150086)

工业大麻是一种古老的作物，在我国种植历史悠久，据考证在南北朝时期已有种植，主要用于纺织、造纸、榨油等[1]。随着现代科技发展，工业大麻产业规模越发兴茂，上等的纤维麻制品可远销国外，优质的麻籽食品、食用油备受广大消费者青睐，雌花提取出的多种大麻素应用更加广泛，掀起新一轮的生物材料革命。

大麻素是工业大麻植株中特有的一类萜烯酚类化合物，可分为酚类物质和非酚类物质，其中酚类物质以大麻二酚(cannabidiol，CBD)、四氢大麻酚(Δ9-Tetrahydrocannabinol，THC)为主，大麻萜酚(cannabigerol，CBG)、大麻环萜酚(cannahichromene，CBC)的含量稍逊色，余下的100 多种萜烯酚类物质含量较少[2]，药用价值有待进一步开发。

在国际上，大麻通常分为毒品大麻和工业大麻，在我国根据THC 和CBD 含量，可进一步将其分为毒品大麻(THC 含量高于0.3%)、工业大麻(THC 含量低于0.3%，CBD 含量低)、药用大麻(THC 含量低于0.3%，CBD 含量高)[3]。目前，药用大麻主要培育方向仍是高CBD 含量大麻[4]。CBD 的作用广泛，已证明其具有消炎镇痛、抗抑郁焦虑、治疗癌症等作用，近期研究[5-8]显示，CBD在皮肤病变治疗、创伤应激障碍治疗、抗COVID-19 及其他呼吸系统疾病等方面也具有一定疗效，是一种多功能、疗效强、潜力深的医学原料。

国外对药用大麻的研究处于领先地位，受限于法规政策，国内药用大麻的发展起步较晚，但在一些领域的研究已赶超国外[9-11]。针对国际市场CBD 供不应求的现状，诸多科研团队为缓解供需压力，在植株生长处理、田间管理改良、次生代谢通路及相关基因等方面均探究出CBD 增产方法或主要影响因素的成果。本文针对影响CBD 产量的遗传因素、外界环境因素进行系统性阐述，旨在为药用大麻产业的发展提供新思路。

1 环境因素

在作物生长发育的进程中，除了受到内源遗传调控外，还易受到外界环境因素的影响，使得同一地块产出的生物量出现波动[12]。在工业大麻中，大麻素的产生与积累极易受到外界因素的影响。

1.1 光照模式

工业大麻属于喜光、短日照植物，收获大麻素的主要工艺器官是雌花，雌花顶叶中大麻素含量最高，光照对于花期的影响较大，也是能够影响大麻素积累的主要环境因素之一。

在Eichhorn 等[13]的研究中指出，美国将室内培育工业大麻列为能源密集型产业之一，室内PPFD(光合光子通量密度)达到1500 μmol/m2/s 时，可获得稳定、高产、高质量的大麻素。研究[14]表明，为植株提供特定波谱的光照，能够改变植株的形态，如:叶面积、叶片数量、花芽大小等。Mahlberg 等[15]研究发现，使用约450 μmol/m2/s 的绿光照射工业大麻植株情况下，THC 的含量呈现下降趋势；Magagnini 等[16]证明在约450 μmol/m2/s 的蓝光(12 h 光照、12 h 黑暗)下种植的工业大麻，大麻素含量得到有效提升，类似地UV-A 能够与蓝光协同促进大麻酚类物质的积累。在光照时间的研究中，张静等[17]发现光照强度为460 μmol/m2/s 情况下，12 h 光照的工业大麻植株CBD 含量与8、10 h 光照处理的呈显著性差异。上述研究表明，在室内或田间种植工业大麻时，合理选择光周期时间、光谱波长可提高CBD 的最终产出。

1.2 土肥管理

工业大麻是一种具有抗旱能力的作物，适宜种植在透水性好、富砂土的坡岗地，黑龙江省种植药用大麻有一定历史，对田间土肥管理摸索出部分技术要点。

药用大麻温室种植的肥料管理尤为重要，为了保证秧苗的快速营养生长，至少需要施加能够提供90 kg/hm2氮、60 kg/hm2钾、40 kg/hm2磷酸盐的肥料，同时增添其他特殊肥料有效提升CBD产量[18]。如可每周喷施稀释800 倍的鲜牛奶以增加植株含钙量、乳酸菌含量和蛋白酶活性；浇水时可按照75 kg/hm2添加鱼蛋白营养液，丰富植株有机质；在开花后叶面喷施600～1000 倍甲壳素营养液，在花叶表面形成角质保护层降低CBD 挥发损耗；收获花叶前15 d，追加高质量钾肥，进一步促进CBD 积累，同时避免次级代谢底物合成为THC。适宜的田间管理技术，是保障CBD 增产、稳产的有效手段。

1.3 生物胁迫

大麻素具有一定的抗虫性，使得工业大麻具有较好的抗虫能力。在McPartland[21]的统计中，约300 种害虫能够对工业大麻植株造成损害，其中只有少数几种对植株的破坏力较强，可能造成经济效益的流失，如欧洲玉米螟虫(Ostrinia nubilalis)、大麻螟虫(Grapholita delineana)。Park 等[22]的研究中，意外地发现烟草角虫(Manduca sexta)使得工业大麻植株中CBGA、CBG、CBD 的含量明显降低，与预期的结果不同，推断烟草角虫的反流物抑制了植物的防御系统。在其他研究中[23]，昆虫造成生物胁迫，是非常有效的大麻素含量提升刺激剂。不同的昆虫对CBD 产量影响模式不同，适宜昆虫刺激产生的生物胁迫能否应用为增产技术，有待进一步挖掘。

1.4 物理刺激

在生产中，除了通过土肥调整措施提高产量外，还可采用一些物理刺激提升大麻素的含量[19]。物理刺激的方法通常包括遮光处理、收获前降温或冷水浇灌、人工机械损伤等，通过刺激触发工业大麻植株的应激系统，促进次生代谢产物的产生，最终达到使CBD 增产的目的。在程超华[20]的研究中，对工业大麻花期雌性植株材料的茎秆施加机械穿刺，在损伤后的2 d 内CBD 和THC 含量显著提升，JA、SA、ABA 等激素水平也随之改变。鉴于成本偏高、操作复杂等方面原因，通过物理刺激提升CBD 产量的研究相对较少。

1.5 外源激素

自发现植物激素以来，通过喷施外源激素来增产的方式已广泛应用于多种作物中[24]，外源激素对大麻素的产生与积累的影响少有研究[25]。Apicella 等[26]的研究证实，喷施茉莉酸甲酯(Me-JA)能够提升大麻素含量，在之前研究中JA 被认为可能参与调控腺毛发育和次生代谢合成。吴姗[27]对于激素影响大麻素含量的研究比较深入，使用多种外源激素处理工业大麻材料，并测定大麻素含量以探寻合适的增产激素，其证实:200 mg/L 的ETH 喷施工业大麻花叶能显著提升CBD 产量，同时THC 的含量也有所提升；喷施赤霉素(GA3)后，短期内能够提升CBD 含量，随时间延长大麻素含量显著降低；20 mg/L 的激动素(KT)喷施花叶后，CBD 可提高69.08%，增产一半以上，但THC 的含量有所提升。外源激素虽能达到增产目的，但THC 与CBD 含量通常同步增加，多种外源激素联合喷施可能会产生抑制THC 产量、提高CBD 产出的效果，在工业大麻中该项研究尚为匮乏，在其他作物中有所试验[28]。

2 遗传因素

自1995年鉴定得到四氢大麻酸合成酶(THCA)以来[29]，大麻素合成途径备受关注，THC、CBD、CBG 等主要大麻素的代谢途径目前已基本明了，关键的合成酶OAC、PT、AAE 等已有所研究。随着科技进步，更多的合成酶基因、转录因子、激素信号分子、结构基因等为学者们发现和解析[30]，进一步了解THC、CBD 等大麻素的调控机理指日可待。

2.1 腺毛发育

腺毛是植物外部防御的重要屏障之一，可分为分泌型和非分泌型，分泌型腺毛是工业大麻花叶中产生和存储大麻素的主要器官[31]，分泌型腺毛根据形态特征可进一步分为头状有柄腺毛、头状无柄腺毛、球状腺毛[32]，其中有柄腺毛能够产生的大麻素种类最多，且分泌能力最强[33]。目前工业大麻中腺毛发育的调控机制尚不清楚，但在其他植物中已有研究证实，R2R3-MYB和HD-ZIP IV(plant-specific homeodomain zipper family IV)转录因子家族参与到无柄腺毛发育为有柄腺毛的进程[34]。在Haiden 等[35]的研究中，发现在本氏烟中过表达R2R3-MYB转录因子家族的CsMIXTA，能够增大腺毛的体型和密度，并促进分支的产生，工业大麻中过表达CsMIXTA可能会提升大麻素的产量。在Ma 等[36]对工业大麻HD-ZIP IV转录因子的全基因组鉴定和表达分析中，鉴定到9个HD-ZIP IV转录因子，与拟南芥、水稻的HD-ZIP IV基因家族有共同的祖先，该基因家族中有4个主要在花中表达，可能参与到腺毛形态发育与次生代谢产物的调控。

在工业大麻的其他组织器官内大麻素的含量很低，因大麻素具有细胞毒性，会对正常的植物细胞产生一定的毒害，而腺毛细胞的抵御机制能够削弱毒性，使得大麻素主要存在于雌花中，同时细胞毒性也是工程菌生产大麻素难的主要原因之一。Wang 等[37]对工业大麻转运蛋白MATE(Multidrug and toxic compound extrusion proteins)家族进行了鉴定与分析，发现MATEs 蛋白除了能够转运植物激素、各种离子外，还可以转运大麻素到细胞内，避免其遭受不必要的修饰(如糖基化)和对细胞产生毒性；RT-PCR 结果显示，CsMATEs家族的CsMATE23、CsMATE28 和CsMATE34 主要在花中表达，推测其可能参与到大麻素的转运，UV-B 可以提升大麻素的产量，在UV-B 处理下CsMATE23、CsMATE34 的表达量有所提升，二者呈正相关，CsMATEs可能在大麻素的生物合成与分泌中发挥重要作用。多种转录因子与基因的研究，填补了腺毛发育分子机制的部分空白，为今后阐明腺毛发育和大麻素增产提供了新方向。

2.2 花发育

花的发育情况也是影响大麻素产生与积累的主要因素，其他植物中调控花发育的基因在工业大麻中被认为具有相似的作用。如Lu 等[38]的研究中:通过全基因组表达分析从工业大麻中共鉴定出51 个bZIP基因家族成员，CsbZIP2、CsbZIP8、CsbZIP15 和CsbZIP325 等在花、苞片、茎和种子中均有表达，尤其是CsbZIP2、CsbZIP8 在花和苞片中呈高表达；已证实水稻中bZIP56、bZIP64、bZIP79 参与酚类和萜类化合物的合成[39]，CsbZIP25、CsbZIP32 的结构与之十分相似，亲缘关系较近，推断其可能参与大麻素的合成。

陈晗等[40]对工业大麻PEBP基因家族分析中，共鉴定出12 个PEBPs基因，主要参与到光形态建成、花的发育和调控等，该基因家族的启动子中多包含光反应顺式调节元件、脱落酸反应顺式作用元件以及茉莉酸响应元件等，其他参与花期的基因CsCOL、CsHd3a也有类似的元件[41]。上述提到的CsMATE23 等的启动子中同样包含丰富的光响应顺式作用元件，而在外源激素喷施的研究中，茉莉酸能够提升大麻素的含量，推测PEBP基因家族等FT 家族成员与大麻素的产生与积累存在一定联系。

2.3 合成途径及相关基因

大麻素及相关酶类主要在腺毛中合成和分泌，基本的代谢合成途径已阐述明了[42]。整个合成途径以CBGA 为中心前体，CBGA 主要由两个前体物质OLA 和GPP 经过异戊烯基转移酶(PT)合成而来，其中OLA 是2-甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)途径合成的乙酰辅酶A 在聚酮合酶(OLS)催化下产生，而GPP 来自焦磷酸香叶酯(GPP)合成途径；随后CBGA 作为前体物质，经由不同的合成酶氧化环化成不同的大麻素，如大麻二酚酸合酶(CBDAS)催化产生CBDA，四氢大麻酸合酶(THCAS)催化产生THCA，这些大麻素还可进一步变化为同系物或其他大麻素。

大麻素的代谢途径较长，提升底物浓度能够提高大麻素的最终产量，对DXR、DXS、HDR、HDS、MCT、MDS、OAC、PT等参与前体物质合成的基因如何受到调控尚不明朗，目前多数研究主要针对大麻素合成酶展开。常丽等[43]对CBDA1 进行生物学分析，发现该基因编码544 个氨基酸，其二级结构丰富，包含较多蛋白质修饰及活化位点，表明CBDA1 在体内受多种因子调控。潘根等[44]对CBDAS基因家族进行全基因组鉴定，共分析出5 个成员，部分成员在雌蕊中表达量很高，该家族基因的启动子中普遍存在较多光响应元件，且激素响应元件含量丰富，证实光照、激素是影响CBD 产量的重要因素；在针对高CBD 品种与低CBD 品种的表达量鉴定中，高CBD 品种CBDAS1 的表达量显著增加。姜颖等[45]对CsTHCA进行克隆，结果发现:该基因共编码545 个氨基酸，证实基因的多态性是不同品种THC 含量差异的主要原因，且CsTHCA的表达量与THC 含量呈现正相关；简单的提高底物浓度或丰富CsCBDAS表达量仅能在一定限度内提升CBD 产量，中间或旁支代谢通路可能会截取前体物质，通过分子育种手段抑制CsTHCA的表达实现CBD 产量提升是可行的。

3 结语与展望

药用成分CBD 的增产一直是药用大麻领域的研究热点，众多学者在药用大麻生长发育进程中选取不同的切入点，从腺毛的发育到花的建成，从植株的营养生长时期到工艺成熟期，从土肥管理到物理刺激，针对CBD 含量提升进行深入的研究，为指导药用大麻产业发展提供了丰富的数据基础。

在许多研究[46-47]中，影响CBD 含量的因素间接或直接指向了光照和植物激素，对不同基因(如bZIP、PEBP、CBDAS等)进行生物信息学分析，均在启动子区域发现了光反应元件或植物激素响应元件，其他转录因子如C2H2、GRAS等也被证实参与到大麻素的合成，二者在响应逆境胁迫中具有重要作用，与本文所述的物理刺激或胁迫能够提升大麻素含量的研究不谋而合。因而，探究外界环境因素的影响，要与内源遗传因素相结合才能进一步了解大麻素合成与积累的奥秘。

除本文叙述的产量提升方法外，一些学者对新方向进行了尝试，如CBD 原材料提取方法的改良，Tiago 等[48]使用DESs 取代常规的提取液，能够有效保留CBD 的生物活性，减少叶绿素和蜡质等杂质留存并大幅提高萃取率。生物工程菌生产大麻素因大麻素的生物毒性很难实现，但在Luo等[49]的努力下，酵母生产大麻素成为现实，通过给工程菌株喂食不同的脂肪酸辅以简单的化学合成进行补充，得到了大麻素类似物。自Mechoulam 等[50]确定CBD 结构以来，已有诸多学者通过化工手段实现了CBD 的合成[51]，基因改造酵母合成大麻素是工业大麻合成生物学领域的创举，有望构建完整的大麻素体外合成产业链。

在其他作物中有“理想株型”的理念，在药用大麻领域，也可以存在类似的期望，即通过多种生物学手段培育出高前体底物、高表达CBDAS、基因敲除或沉默THAS且能够正常生长发育的药用大麻品种，辅以合适的田间水肥、光照管理，并在收获前进行合适的物理刺激，最终获得高产CBD。室内培育药用大麻技术还需要进一步探索，可尝试提高正常光照的光强和补充UV-A 和蓝光等光质来促进CBD 的产生和积累。本文就影响CBD 产生与积累的主要因素进行总结，进一步拓宽CBD 的研究方向，为药用大麻产业提供合理导向。