结球甘蓝类钙调蛋白基因 CML48和 CML50在不同胁迫下的表达分析

李振林,彭梦玲,2,苏 甜,2,吕 霞,张国平,张应华,许俊强

(1.云南农业大学 云南省滇台特色农业产业化工程研究中心,昆明 650201;2. 云南农业大学 园林园艺学院,昆明 650201)

干旱、盐胁迫、高温、低温等非生物胁迫严重影响植物的生长发育,是影响作物产量的主要因素[1-2],而水杨酸、茉莉酸甲酯、脱落酸等植物激素可作为植物抗逆反应所需的信号分子来激活植物防御保护机制[3]。钙结合蛋白广泛参与植物抗逆境反应过程,对钙结合蛋白的研究是Ca2+信号转导的关键环节[4-5]。

类钙调蛋白(Calmodulin-Like Protein, CML)是植物特有的Ca2+受体蛋白中一个大的亚家族,具有EF-hand结构域[6],是Ca2+信号传导的关键部分[7]。目前已经在多种植物中鉴定了CMLs基因。其中拟南芥50个AtCMLs[8],水稻32个OsCMLs[9]、大豆68个GmCMLs[10],棉花60个GrCMLs[11],番茄中有52个ShCMLs[12],百脉根19个LjCMLs[13],白菜79个BrCMLs[14],结球甘蓝76个BoCMLs[15]。相较CaMs,CMLs更多地参与到植物的非生物、激素胁迫响应。研究表明,AtCML9可通过调节ABA通路提高植物的耐盐性[16];OpCML13在NaCl胁迫下表达明显增强[17];AtCML15参与调控Na+/H+逆向转运蛋白AtNHX1的活性,提高植物耐盐性,AtCML15与NHX1互作降低Na+/H+交换的活性,在逆境胁迫时发挥作用[18];CML24能够响应高温、低温、氧胁迫及ABA的诱导表达[19];AtCML24在植物各个部位均有表达,受到触碰、黑暗、高温、低温、H2O2、ABA和IAA处理时表达水平逐渐增强[20];GsCML27可以通过Na+、K+含量和调节渗透压力降低耐盐性[21];水稻OsCML4可通过清除活性氧及ABA独立方式诱导其他应激相关基因表达来提高耐旱性[22];OsMSR2(Multi-Stress- Responsive gene 2)与AtCML37、AtCML38和AtCML39序列高度相似,通过调节ABA通路提高对干旱和盐碱的抗性[23];AtCML42/43能够参与生物和非生物胁迫[24];具有ShCML44超表达的番茄植株在寒冷和干旱胁迫条件下,膜损伤程度降低,抗氧化酶活性、气体交换和保水性增强;还表现出ROS减少和相对水含量增加的现象[12];OsCML16的表达可增强植株的根系生长和耐旱性[25]。由此看出,多种植物的多个CMLs参与植物高温、低温、干旱、盐胁迫及其他激素胁迫,并在不同的胁迫下行使不同的功能。

结球甘蓝(BrassicaoleraceaL. var.capitata)是十字花科芸薹属重要的蔬菜作物,全国广泛种植[26]。但在甘蓝生长发育过程中经常受到干旱、高盐、低温、高温和病虫害等逆境胁迫。目前很多CMLs家族成员的功能还是未知的,但已知的成员在不同的生长发育过程及环境条件下发挥着重要作用,结球甘蓝CMLs有些家族成员已经被鉴定,但CML48和CML50未见报道。本研究从结球甘蓝中克隆得到CML48和CML50,对两者在不同非生物胁迫后的表达进行分析,初步解析CML48和CML50响应8种不同胁迫下的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

结球甘蓝材料(ZG)(BrassicaoleraceaL. var.capitata)由云南农业大学滇台中心实验室保存。植物总DNA、RNA提取试剂盒(天根,北京)购自天根生化科技(北京)有限公司;pEASY-Blunt Simple Cloning Kit,大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1,Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker,TransStart FastPfu Fly DNA聚合酶(全式金,北京)均购自全式金公司;逆转录试剂盒、5×All-In-One RT MasterMix等(ABM,美国)购自ABM公司;昆明硕擎生物科技有限公司合成引物及 测序。

1.2 结球甘蓝 CML48和 CML50的cDNA和gDNA的克隆

各取100 mg 2～3片真叶期的甘蓝茎尖,研钵中加液氮迅速研磨,分别提取总RNA及DNA,1%琼脂糖凝胶电泳及浓度检测,质量完好的RNA逆转录合成第一链cDNA,置-20 ℃ 保存。

参考结球甘蓝基因组的序列设计引物(表1),通过PCR扩增,克隆CML48和CML50基因全长,PCR 反应体系为PCR Mixster Mix 5 μL、dNTPs 2.5 μL、上/下游引物各1 μL、FastPfu Fly DNA聚合酶1 μL、cDNA 模板1 μL 、ddH2O至25 μL;反应程序为95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,38个循环;72 ℃ 5 min。PCR产物连接克隆载体,转化大肠杆菌感受态细胞,PCR检测正确后进行测序。

表1 本研究所使用的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 基因序列及蛋白生物信息学分析

序列检索及比对采用BLAST在线程序进行,其他物种中的同源氨基酸序列由NCBI网站下载。分别采用ProtParam Tool(https://web.expasy.org/protparam/)及ProtScale(https://web. expasy.org/protscale/)在线软件对蛋白理化性质和亲疏水性进行分析;利用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽预测;TMHMM(http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜域分析;利用NCBI中CDD(Conserved Domain Database)程序(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/cdd)进行保守结构域分析,利用SWISS-MODEL(https://swissmodel．expasy．org/)在线软件进行蛋白三级结构建模。采用DNAMAN v6.0及Muscle软件进行序列同源性比对分析。系统发育进化树利用MEGA 7.0软件,采用Neighbor-joining进行构建。

1.4 结球甘蓝材料种植及胁迫处理

挑选饱满的甘蓝种子,播种到腐殖土∶珍珠岩=1∶1(体积比)的50孔穴盘中。种子出芽后,25 ℃光照16 h、20 ℃黑暗8 h培养,待植株长至2～3片真叶时进行以下不同胁迫处理。参考赵陆滟等[27]的方法将2～3片真叶期的幼苗分别置于15% PEG-6000、200 mmol/L NaCl溶液中水培处理0、1、3、6、12和24 h;将甘蓝幼苗分别放入4 ℃、37 ℃恒温培养箱分别生长0、1、3、6、12和24 h;将幼苗分别置于配制好的30 mmol/L H2O2、100 μmol/L ABA、2 mmol/L SA、100 μmol/L MeJA溶液中水培处理0、1、2和4 h。分别取不同处理的植株幼嫩叶片及根,液氮速冻后-80 ℃冰箱保存。

1.5 结球甘蓝 CML48和 CML50胁迫表达分析

分别提取不同处理植株幼苗的茎尖和根组织的总RNA,以β-Actin为内参基因,在Bio-RAD CFX96荧光定量PCR仪上进行。反应体系为EvaGreen 2× qPCR MasterMix 10 μL,引物各0.6 μL,cDNA 模板1 μL,补水至20 μL。扩增程序为95 ℃预变性3 min;95 ℃ 15 s,57 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共39个循环。采用2-ΔΔCt方法进行CML48和CML50基因在不同处理下相对定量表达分析。

2 结果与分析

2.1 结球甘蓝 CML48和 CML50基因的克隆

依据结球甘蓝基因组信息,设计特异性引物。分别以CML48-F/ CML48-R、CML50-F/ CML50-R为正反向引物,从结球甘蓝茎尖cDNA中分别扩增得到CML48和CML50基因,测序分析表明两者大小分别689 bp和1 112 bp,包含完整开放阅读框分别为672 bp和1 095 bp(图1-A和1-B);以CML48-F/ CML48-R、CML50-F/ CML50-R引物从甘蓝基因组中gDNA分别扩增得到CML48、CML50全长分别为1 051 bp和 1 705 bp(图1-C和1-D)。CML48、CML50gDNA序列中分别含有4个和3个内含子。经测序及NCBI序列比对表明该基因正确为CML48、CML50。

M. Trans2K plus Ⅱ;A. CML48基因cDNA克隆;B. CML50基因cDNA克隆;C. CML48基因gDNA克隆;D. CML50基因gDNA克隆

2.2 结球甘蓝 CML48和 CML50基因及编码蛋白序列分析

序列分析表明:CML48基因编码223个氨基酸,蛋白质分子量为25.28 ku,pI为4.54,含有2个EF-hand结构域,分别位于50～78、118～146位氨基酸处,在69、138位处含有保守的谷氨酸(E)(图2-A),亚细胞定位预测CML48蛋白定位于细胞核中;CML50基因编码364个氨基酸,蛋白质分子质量为38.06 ku,pI为6.27,该序列中含有2个具有钙离子结合能力的EF-hand结构域,分别位于 197～225、263～291位氨基酸处,在217、183位处含有保守的谷氨酸(E)(图2-B),亚细胞定位预测CML50蛋白定位于细胞膜和细胞核中;结球甘蓝CML48和CML50基因编码蛋白均不含信号肽,不含跨膜域,为胞外蛋白,均为亲水性蛋白。

2.3 结球甘蓝 CML48和 CML50编码蛋白的同源性比对分析

利用NCBI数据库和甘蓝基因组数据库(http://www.ocri-genomics.org/bolbase/ index.html)对CML48和CML50氨基酸同源序列进行检索和比对,发现CML48与甘蓝、白菜和油菜的氨基酸序列同源性分别为98.65%、96.41%和95.52%(图2-A);CML50与甘蓝、白菜和油菜的氨基酸序列同源性分别为100%、96.47%和 97.28%(图2-B)。

2.4 结球甘蓝 CML48和 CML50进化分析及三级结构预测

利用DNAMAN6.0.3软件进行多序列比对,在氨基酸水平上,结球甘蓝CML48与白菜(Brassicarapa[XP_009122631.1])和油菜(Brassicanapus[XP_013668396.1])氨基酸序列同源性最离,均达到98%;结球甘蓝CML50与白菜(BrassicarapaXP_009122631.1])和油菜(Brassicanapus[XP_013668396.1])氨基酸序列同源性最高,均达到98%。用MEGA 7.0软件以氨基酸作为分析对象进行多序列比对,绘制分子进化树(图3-A和3-B),分析结果表明结球甘蓝与白菜(Brassicarapa)、油菜(Brassicanapus)的亲缘关系最近。利用SWISS-MODEL对CML48、CML50蛋白进行三级结构预测(图3-C和3-D)。

A.结球甘蓝 CML48系统进化树; B.结球甘蓝 CML50系统进化树;C.结球甘蓝 CML48三级结构预测 ;D.结球甘蓝 CML50三维级结构预测;图中小球代表Ca2+

2.5 结球甘蓝 CML48和 CML50在干旱、NaCl、高温和低温胁迫条件下的表达

对结球甘蓝CML48基因在干旱、NaCl、高温、低温胁迫下的表达分析表明(图4、图5)。模拟干旱条件下,CML48的表达量在茎尖和根中均呈现先升后降的趋势,茎尖中,PEG6000处理1 h后CML48的表达量迅速上升,3 h后达到最高约0 h的5.3倍,后逐渐下降;在根部,CML48表达量1 h时达到最大值,约为0 h的2.8倍,后缓慢下降至0 h的水平。CML50在模拟干旱胁迫下在茎尖和根中均高度表达,茎尖中1 h表达急剧增高,3 h最大值约为0 h的50倍,6 h下降到0 h的34倍,并趋于稳定;根部中,处理1 h 后CML50表达量达到最大,约为0 h的84倍,3 h后骤降到32倍并缓慢降低。NaCl胁迫下的茎尖中,处理1 h后CML48的表达量开始上升,6 h达到最大值约为0 h的3.65倍,而后下降但高于对照,12 h和24 h时NaCl处理无显著差异,约为0 h的2倍;在根部,处理1 h 后CML48表达量下降,6 h下降到最低约为0 h的0.37倍,其中处理3 h、6 h、24 h时的表达量显著低于对照,处理12 h的表达量与0 h无显著差异。CML50在NaCl胁迫时在茎尖和根中处理均有较高表达,在茎尖中呈先上升后下降再上升的趋势,茎尖中 1 h后均急剧上调表达,达到对照的20倍,3 h后达到较高水平,24 h后达到最高为0 h的51倍,根中CML50表达量急剧上升,3 h达到最高值为0 h的20倍,后下降并维持在17倍左右的水平。低温胁迫下的茎尖中,处理1 h后CML48的表达量迅速上升,约为处理 0 h的近4.8倍,6 h急剧下降达到最小值约为0 h的0.4倍,而后又上升,24 h达到最高峰值约为0 h的6.8倍,1 h和3 h处理无差异;在根部,呈现先升后降的趋势,处理6 h时CML48表达上升到最大值约为4.5倍,12 h后下降到对照水平。CML50在低温胁迫下的表达总体呈上升趋势,24 h表达急剧增高到最大为0 h的84.4倍;根中CML50表达量先上升后降低,1 h和3 h均到达0 h的14倍,6 h到达最高值约为0 h的49倍,后下降到20余倍。高温胁迫下的茎尖中,处理1 h后CML48的表达量迅速上升,3 h后达到最高约0 h的43倍,而后急剧下降达到最小值,6～24 h稳定到0 h表达水平;在根部,随着处理时间的延长,CML48表达量总体无差异。高温胁迫下在茎尖和根中CML50基因均高度表达,茎尖中1 h表达量剧增到最大,达到0 h的154倍,3 h后急剧下降到约为0 h的60倍左右,并趋于稳定;根部中,高温胁迫处理1～24 h表达量总体处于较高水平,约为 0 h的50倍左右,且趋于稳定。综上说明结球甘蓝CML48在茎尖中和根中均响应干旱、NaCl、高温、低温胁迫,且在茎尖中的表达量总体高于根部,甘蓝CML48仅在茎尖响应高温胁迫,而在根中无响应;CML50高水平响应干旱、NaCl、高温、低温胁迫,在胁迫诱导下的茎尖和根部均有高水平的上调表达。

不同小写字母表示差异显著性(P<0.05),下同

图5 结球甘蓝 CML50在干旱、NaCl、4 ℃及37 ℃胁迫下的表达Fig.5 Expressions of CML50 under PEG6000,NaCl,4 ℃ and 37 ℃ stresses

2.6 结球甘蓝 CML48和 CML50在H2O2、SA、ABA及MeJA胁迫条件下的表达

对甘蓝CML48和CML50在H2O2、SA、ABA及MeJA胁迫下的表达分析,结果表明(图6、图7)。茎尖中,H2O2处理1 h后CML48的表达量与0 h相当,2 h时迅速上升达到最大值,约为0 h的8.8倍,4 h时迅速下降但显著高于对照;而在根部,H2O2处理CML48基因表达量无差异。在茎尖和根中CML50表达量均高度表达,茎尖中2 h表达量剧增到最大,达到0 h的100.6倍,后急剧下降,但总体处于高表达水平;根部中,H2O2处理CML50表达量总体处于较高水平,约为0 h的24倍左右,且处于稳定水平。说明甘蓝CML48在干旱胁迫下对茎尖的响应较大,而在根中无响应;而CML50在根与茎尖中均较高表达。ABA胁迫茎尖中CML48表达量有所增加,约为0 h的2倍左右,显著高于对照并稳定在这一水平;根部中,ABA处理1～4 h表达量呈上升趋势,4 h增加达到最高为0 h的3.1倍,显著高于其他时间。ABA处理下,CML50基因7茎尖和根中均高度表达,且在茎尖和根部的表达量基本一致;处理1 h表达量均急剧增高,4 h时均达到最高,均为对照的30倍左右。说明CML48响应ABA在甘蓝根部胁迫,CML50在茎尖和根中均响应ABA胁迫,且响应程度基本一致,ABA对甘蓝茎尖和根部的生长发育起到重要作用。SA胁迫的茎尖中CML48表达量呈先升后降的趋势,1 h表达量显著高于对照,2 h达到最高值为0 h的3.5倍,4 h下降到起始水平;根部中,SA处理1～2 h表达量与0 h无差异,4 h达到最高约为0 h的4.8倍;CML50在SA处理下在茎尖和根中均高度表达,茎尖中CML50表达量呈先升后降的趋势,1 h 后急剧升高,2 h达到最高约为0 h的40.6倍,4 h时下降到0 h的17.6倍;根部中,CML50表达量1 h急剧增高, 2 h与1 h无差异,4 h达到最高约为0 h的42倍。说明CML48、CML50在SA胁迫诱导下均有表达变化,表明结球甘蓝两基因响应SA胁迫。MeJA处理时,随着MeJA胁迫处理时间的延长,在茎尖中CML48基因表达量呈先升后降的趋势,处理2 h后的表达量达到最高为0 h的5.5倍,4 h时迅速下降至0 h的3.2倍,显著高于对照;在根部,CML48表达量总体呈上升的趋势,处理1 h后CML48表达量降到最低,2 h恢复到原来水平,4 h达到最高为0 h的2.6倍。CML50在茎尖和根中均高度表达,茎尖中CML50基因表达量呈先升后降的趋势,1 h表达量急剧增高,2 h达到最高,约为0 h的57倍,4 h后下降到0 h的27倍,总体处于较高的表达水平;根部中,MeJA处理时CML50呈上升趋势, 4 h达到最高,约为0 h的39.4倍。综上说明CML48和CML50在H2O2、SA及MeJA胁迫时于茎尖中的响应高于根部,而处理后期在根部响应,但CML48在根中不响应H2O2胁迫,表明CML48和CML50能够响应H2O2、SA、ABA及MeJA胁迫。

图6 结球甘蓝 CML48在H2O2、SA、ABA and MeJA胁迫处理下的表达Fig.6 Expressions of CML48 under H2O2,SA,ABA and MeJA stresses

图7 结球甘蓝 CML50在H2O2、SA、ABA及MeJA胁迫处理下的表达Fig.7 Expressions of CML50 under H2O2,SA,ABA and MeJA stresses

3 讨 论

CMLs是植物中特有的一类Ca2+结合蛋白,在Ca2+信号传导途径中具有重要的作用。目前已在多种植物中克隆了CMLs基因,如巴西橡胶树HbCML27[28]、无苞芥OpCML13[17]、结球甘蓝BoCML49[29]及青稞CML19[30]、大白菜BrCML49[31]等,但不同基因的表达特征及功能研究仍不清楚。本研究从结球甘蓝中克隆CML48和CML50基因,预测编码蛋白均含有2个EF-hand结构域,在EF-hand1、2上均有相同的保守谷氨酸(E)位点,说明CML48和CML50均是EF-hand家族成员。生物信息学分析表明,均属于亲水蛋白,这与巴西橡胶树HbCML27[28]和新疆无苞芥OpCMLl3[17]的预测分析结果一致。系统进化分析表明CML48和CML50均与甘蓝、油菜和白菜亲缘关系较近,氨基酸相似性均达到97%以上,与其他物种较远。在EF-hand1、2、4上均有相同的保守谷氨酸(E)位点,说明CML48和CML50均是EF-hand家族成员。

对拟南芥的研究表明多个CMLs参与逆境胁迫感知:如AtCML24[32]、AtCML37[33]、AtCML38[34]、AtCML39[34]和AtCML42[35]等。ABA、MeJA和SA作为重要的植物激素信号分子,不仅能够调控植物生长发育, 同时参与植物逆境反应[36-37]。cml9突变体提高拟南芥对干旱和盐害的耐受性[38]。新疆无苞芥OpCML13对逆境胁迫的响应非常灵敏, 其在无苞芥响应逆境生理生态环境中可能起着重要的作用[17];AtCML18在液泡中与Na+/H+逆向转运蛋白NHXl (Na+/H+exchanger 1)互作,结合在NHXl的C端,两者互作可能在植物响应盐害反应中起作用[18];AtCML15也可以与NHX1互作,能减少Na+/H+交换的活性,在逆境胁迫时发挥作用[18]。野生大豆GsCML27的异位表达可以通过改变细胞离子(Na+、K+)含量和调节渗透压力来降低耐盐性[21]。赵陆滟等[27]研究表明8种不同非生物胁迫处理均能上调结球甘蓝叶和根中BoCML39的表达。水稻OsMSR2受多种逆境条件的诱导表达,超表达OsMSR2增强植株对ABA的敏感性,可能是通过调节ABA通路上的基因,提高拟南芥对干旱和盐碱的抗性[23]。本研究得到的CML48和CML50均响应非生物胁迫,说明两者受不同逆境条件诱导。对两者而言,CML50响应逆境时均超高表达,反应比较灵敏;而CML48也有响应,但除在茎尖中高度响应高温胁迫外,其余表达量均相对较低,而在高温胁迫和H2O2的根中无响应。由于CML48和CML50基因在其他物种上研究较少,对于CML48和CML50在逆境胁迫调控的通路仍需进一步研究。

CMLs参与植物的各种生长发育、激素调控的细胞活动、病原体防御及各种胁迫的诱导。对CMLs家族功能的研究,将有利于探索CMLs家族成员之间的联系与区别,完善植物钙信号系统网络。目前CMLs家族基因的研究其功能的鉴定还处于初级阶段,CMLs的功能还需进一步 探究。

4 结 论

克隆得到结球甘蓝CML48和CML50基因,均含有2个保守的EF-hand结构域;CML48和CML50均与白菜、油菜的进化关系最近;8种不同胁迫处理均能调控结球甘蓝CML48和CML50基因在茎尖和根中的表达量,且CML50对各胁迫的响应显著高于CML48和CML48在茎尖中高度响应高温胁迫,而在根中不响应高温和H2O2胁迫,表明CML48和CML50响应不同胁迫时的调控过程。