补饲开食料对断奶前后牦牛犊牛生长性能和免疫器官发育的影响

郝文君,刘书杰,郭文杰,张玉莹,张 博,王 音,焦 洋,崔占鸿

(1.青海大学 畜牧兽医科学院,西宁 810016;2.青海省牦牛工程技术研究中心,西宁 810016;3.青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室,西宁 810016)

牦牛是青藏高原地区的优势反刍家畜,其生产性能水平与该地区藏族群众的生产生活关系密切[1]。母牦牛于每年4-6月集中产犊,犊牛出生后采用随母哺乳放牧的饲喂方式进行早期培育[2]。在泌乳期间,母牦牛平均日产乳量仅为 1.56 kg左右[3],犊牛哺乳后只能采食少量的天然牧草,致使其早期营养物质摄入不足,不利于犊牛免疫器官的健康发育,进而影响犊牛对应激以及疾病的抵抗力和恢复力,降低了犊牛的早期生长发育质量[4-5]。免疫系统是在机体发育过程中逐渐建立健全的,免疫器官的功能也是随生长发育逐渐建立完善,此过程中营养物质发挥至关重要的作用[6-7]。肝脏是机体最大的代谢器官,也是连接营养与免疫的枢纽,营养物质对动物免疫器官的形态和功能发育起着重要调控作用[8-9]。胸腺是机体重要的中枢免疫器官,幼年时期体积较大,随着年龄增长逐渐退化,其作为T淋巴细胞发育、增殖、分化与成熟的场所且兼具分泌功能(分泌胸腺肽、胸腺素等激素),在机体细胞免疫中发挥着重要作用[10-11];脾脏聚集了大量的免疫细胞,是产生免疫应答的重要场所,机体接受抗原刺激后,合成具有促进吞噬和调节免疫的促吞噬素[12-13]。目前有关日粮营养调控牦牛犊牛免疫器官发育的相关研究报道很少,生产中对牦牛犊牛期免疫功能的营养调控缺乏科学指导。本研究以牦牛犊牛为试验对象,通过牦牛犊牛舍饲饲喂“代乳粉+苜蓿干草”模拟“随母哺乳+放牧采食牧草”的方法,探究补饲开食料对牦牛犊牛生长性能,肝脏、胸腺和脾脏组织形态发育及其免疫因子分泌的影响,阐释日粮营养水平调控牦牛犊牛免疫机能的量效关系,为牦牛犊牛关键期的营养调控研究提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物及分组

选取30头出生日龄(30±4) d、体质量相近(30.79±3.43)kg、健康的大通牦牛犊牛(公)作为研究对象,牦牛犊牛购自青海省大通牛场,饲养试验在青海省海北州海晏县高原现代生态畜牧业科技试验示范园进行。试验期为2020年7月14日-2021年1月27日,共计230 d,预试期为 30 d,正试期200 d 。

1.2 饲养管理

对照组饲喂代乳粉和苜蓿干草,试验组在对照组的基础上补饲开食料,两组干物质饲喂量保持一致,当固体物质的干物质采食量达到1 kg时(160日龄)牦牛犊牛断奶,两组各屠宰5头牦牛犊牛,试验期130 d,正式期100 d,预试期30 d。断奶后两组剩余牦牛犊牛按燕麦干草∶苜蓿干草(1∶1)与犊牛料7∶3比例饲喂,当体质量达到90 kg左右(230日龄)时两组各屠宰5头牦牛犊牛,试验期200 d,正式期170 d,预试期30 d。代乳粉饲喂时间为每日8:00、14:00和17:00,用煮沸后冷却到42 ℃的温水按1∶5的比例冲泡进行饲喂。试验正式开始时代乳粉饲喂量为0.48 kg/(头·d),代乳粉每5 d 增加0.01 kg;试验结束时代乳粉饲喂量为0.72 kg/(头·d)。30～80日龄时试验组牦牛犊牛按苜蓿干草与开食料 2∶1比例饲喂,81～160 日龄试验组牦牛犊牛按苜蓿干草与开食料1∶1比例饲喂,161～230日龄两组牦牛犊牛按苜蓿干草∶燕麦干草(1∶1)与犊牛料7∶3比例饲喂,试验饲料的营养水平见表1,不同日龄的饲粮组成及营养水平见表2。160日龄代表断奶前的阶段,230日龄代表断奶后的阶段。试验犊牛分单圈饲养,圈舍始终保持卫生良好,通风顺畅,定期消毒。代乳粉和开食料均购自北京精准动物营养研究中心,犊牛料购自青海河湟青牧饲料科技开发有限公司。

表1 饲料的营养水平(干物质基础)Table 1 Nutrients levels of diet (DM basis) %

表2 不同日龄犊牛的饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 2 Dietary composition and nutritional level of calves at different ages (DM basis) %

1.3 观测指标与方法

1.3.1 生长性能 正试期第1天、第100天和第170天晨饲前称量牦牛犊牛体质量,计算终末体均质量和平均日增质量(ADG),试验期每天记录两组牦牛犊牛的采食量,计算平均日采食量。

平均日增质量=(末期体质量-初始体质量)/试验天数。

1.3.2 样品采集 分别于160日龄和230日龄时试验组和对照组各屠宰5头牦牛犊牛,采取肝脏、胸腺和脾脏,用滤纸吸干脏器表面血液,修剪成(2×2×2) cm3的组织块,浸泡于4%多聚甲醛,用于制作组织切片。另采取一部分组织小块于 5 mL冻存管,投入液氮,存于-80 ℃冰箱,待测。

1.3.3 肝脏、胸腺、脾脏组织形态观察 采用常规石蜡切片HE染色进行组织学形态观察。 Olympus光学显微镜观察2组牦牛犊牛肝脏、胸腺和脾脏组织结构,并应用Motic image plus 2.0ML显微图像分析测量软件测量胸腺小叶的皮质、髓质厚度,测量胸腺髓质和皮质的面积、计算胸腺皮质/髓质比例;测量脾脏中脾小结的半径、红髓和白髓的面积,取平均值。

1.3.4 肝脏、胸腺、脾脏激素和细胞因子的测定 将组织样品从-80 ℃冰箱中取出,称取0.2 g左右,将组织磨碎,加入9倍体积的生理盐水,冰浴匀浆,4 ℃、3 000 r/min离心15 min;取上清液,分装待测。

Elisa法测定脾脏中促吞噬素,胸腺中前胸腺素α、胸腺素β-4和胸腺肽,肝脏、胸腺和脾脏中免球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等。试剂盒均购自江苏酶标生物。

1.4 数据处理与统计分析

将得到的数据经Excel 2019初步处理后,再利用SPSS 20.0分析数据,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较数据差异性,结果用“平均数±标准差”表示,以P<0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 补饲开食料对牦牛犊牛生长性能的影响

由表3和表4可知,160日龄试验组牦牛犊牛平均日采食量、净增质量和平均日增质量均显著高于对照组(P<0.05);230日龄试验组牦牛犊牛净增质量和平均日增质量显著高于对照组(P<0.05),平均日增质量差异不显著(P> 0.05)。

表3 对照组和试验组160日龄牦牛犊牛生长性能Table 3 Growth performance of 160-day-old yak calves in control and test groups

表4 对照组和试验组230日龄牦牛犊牛生长性能Table 4 Growth performance of 230-day-old yak calves in control and test groups

2.2 补饲开食料对牦牛犊牛肝脏发育的影响

2.2.1 对肝脏组织形态的影响 由图1可知,牦牛犊牛肝脏大多数肝细胞排列成单层,细胞界限明显,细胞核大而圆,位于中央,清晰可见,160日龄和230日龄试验组牦牛犊牛肝脏细胞核较对照组排列稀疏,说明试验组牦牛犊牛肝细胞较大,发育更好。

1～4.分别表示160日龄对照组、160日龄试验组、230日龄对照组、230日龄试验组牦牛犊牛的肝脏组织切片。a.肝细胞核

2.2.2 对肝脏细胞因子分泌的影响 由表5可知,160日龄试验组牦牛犊牛肝脏IgM、M-CSF、IFN-β和IFN-γ含量显著高于对照组(P< 0.05),两组间肝脏IgG、IgA、IL-2、、IL-4、IL-6、IFN-α和TNF-α含量差异不显著(P>0.05);230日龄试验组牦牛犊牛肝脏IgA 、IL-2、IL-4、IFN-α、IFN-β和TNF-α含量显著低于对照组 (P<0.05),两组间肝脏IgG、IgM、IL-6、M-CSF和IFN-γ含量差异不显著(P>0.05)。

表5 对照组和试验组牦牛犊牛肝脏细胞因子分泌含量Table 5 Secretion content of cytokine in liver of yak calves in control and test groups

2.3 补饲开食料对牦牛犊牛胸腺发育的影响

2.3.1 对胸腺组织形态的影响 由图2可知,牦牛犊牛胸腺小叶界限分明,皮质与髓质分界明显,皮质染色较深,髓质染色较浅,160日龄和230日龄试验组牦牛犊牛胸腺皮质面积较对照组大。

1～4.分别表示160日龄对照组、160日龄试验组、230日龄对照组、230日龄试验组牦牛犊牛的胸腺组织切片;a.髓质;b.皮质

由表6可知,160日龄试验组牦牛犊牛胸腺皮质厚度、皮质/髓质面积比均显著高于对照组(P<0.05);230日龄试验组皮质厚度显著高于对照组(P<0.05),皮质/髓质面积比差异不显著(P>0.05)。

表6 对照组和试验组牦牛犊牛胸腺皮质厚度、皮质面积/髓质面积比例Table 6 Thymus cortical thickness and cortex area/medulla area ratio of yak calves in control and test groups

2.3.2 对胸腺激素含量的影响 由表7可知,160日龄试验组牦牛犊牛胸腺中胸腺肽含量显著高于对照组(P<0.05),两组间前胸腺素α和胸腺素β-4均差异不显著(P>0.05);230日龄试验组牦牛犊牛胸腺中胸腺肽含量显著高于对照组(P<0.05),前胸腺素α和胸腺素β-4两组间均差异不显著(P>0.05)。

表7 对照组和试验组牦牛犊牛胸腺激素含量Table 7 Thymus hormone content of yak calves in control and test groups

2.3.3 对胸腺细胞因子分泌的影响 由表8可知,160日龄和230日龄,试验组和对照组牦牛犊牛胸腺中IgG、IgM、IgA、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α等细胞因子含量差异不显著(P>0.05)。

表8 对照组和试验组牦牛犊牛胸腺细胞因子分泌含量Table 8 Secretion content of cytokines in thymus of yak calves in control and test groups

2.4 补饲开食料对牦牛犊牛脾脏发育的影响

2.4.1 对脾脏组织形态的影响 由图3可知,牦牛犊牛脾脏脾小结、红髓和白髓分界明显,160日龄试验组牦牛犊牛脾小结个数和半径较对照组多且大。230日龄两组牦牛犊牛脾脏脾小结个数和半径未见明显区别。

1～4.分别表示160日龄对照组、160日龄试验组、230日龄对照组、230日龄试验组牦牛犊牛的脾脏组织切片;a.脾小结;b.红髓

由表9可知,160日龄试验组牦牛犊牛脾脏脾小结的半径显著大于对照组(P<0.05),两组间红髓、白髓比例差异不显著(P>0.05);230日龄试验组牦牛犊牛脾脏脾小结、红髓和白髓比例均与对照组差异不显著(P>0.05)。

表9 对照组和试验组牦牛犊牛脾脏脾小结半径、红髓和白髓比例Table 9 Radius of spleen and spleen nodules, ratio of red pulp and white pulp of yak calves in control and test groups

2.4.2 对脾脏促吞噬素含量的影响 由表10可知,160日龄和230日龄,试验组与对照组牦牛犊牛脾脏中促吞噬素含量差异不显著(P>0.05)。

表10 对照组和试验组牦牛犊牛脾脏促吞噬素含量Table 10 Content of tuftsin in spleen of yak calves in control and test groups

2.4.3 对脾脏细胞因子分泌的影响 由表11可知,160日龄试验组牦牛犊牛脾脏中IFN-γ含量显著高于对照组(P<0.05),两组间IgG、IgM、IgA、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、IFN-α、IFN-β和TNF-α含量差异不显著(P>0.05);230日龄两组牦牛犊牛脾脏IgG、IgM、IgA、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α含量差异不显著(P>0.05)。

表11 对照组和试验组牦牛犊牛脾脏细胞因子分泌含量Table 11 Secretion content of cytokines in spleen of yak calves in control and test groups

3 讨 论

3.1 补饲开食料对牦牛犊牛生长性能的影响

牦牛传统放牧生产方式下,犊牛出生后采用随母加放牧方式进行培育,此时放牧草地牧草随季节变化其数量和质量营养品质大幅降低,带犊母牦牛泌乳量逐渐下降,母乳和天然牧草中的能量、蛋白质、矿物质、维生素等营养物质不能满足牦牛犊牛发育所需,会造成犊牛生长发育缓慢,同时不利于消化道更好发育[14]。哺乳期犊牛的胃肠道发育未完善,对粗纤维饲粮利用能力较差,适当补充开食料可充分发挥其快速生长的潜力[15]。开食料是一种品质较高的固体饲料,适口性好,适时补饲开食料提高瘤胃细菌活性,促进粗纤维的降解,瘤胃排空速率加快[16]。已有研究表明,补饲开食料是牦牛犊牛从液体向固体采食的一个重要过渡,较早采食开食料可以显著提高幼畜的采食量和生长性能[17]。本研究发现,补饲开食料提高断奶前牦牛犊牛的生长性能和平均日采食量与上述结果相一致。

本试验中,牦牛犊牛断奶之后,两组犊牛的饲粮组成和营养水平一致,可能是两组牦牛犊牛的采食量接近一致的原因。由于前期对牦牛犊牛补饲开食料,促进牦牛犊牛的胃肠道发育与段鹏伟等[18]的研究结果一致,提高牦牛犊牛胃肠道对挥发性脂肪酸等营养物质的吸收和对犊牛料的利用效率,故补饲开食料提高断奶后牦牛犊牛的生长性能。

3.2 补饲开食料对牦牛犊牛肝脏发育的影响

肝脏作为机体最大的代谢器官兼具免疫功能,肝实质细胞占肝细胞的60%～80%,非实质细胞(星状细胞、枯否氏细胞等)占20%～40%发挥其免疫功能[19]。在肝脏代谢过程中,瘤胃发酵、饲粮来源的各种营养素和细菌抗原等通过门静脉进入肝脏,由血液循环运送至全身各个脏器,促进发育并激活机体免疫系统,还有一部分抗原物质随富含氧的血液经肝动脉到达肝脏,激活肝脏的免疫防御机制[20]。IgM由浆细胞分泌,是机体初次免疫应答时产生的抗体[21],干扰素在抗感染和免疫调节中起着重要作用[22],M-CSF促进巨噬细胞的增殖分化[23]。本研究中,补饲开食料断奶前(160日龄)牦牛犊牛肝脏IgM、M-CSF、IFN-β和IFN-γ水平较高,一方面,补饲开食料提高日粮蛋白质水平,促进肝脏中枯否氏细胞等免疫细胞的发育,这与朱雯等[24]研究低蛋白水平饲粮抑制肝脏糖异生,不利于肝脏组织发育的研究结果一致,推测免疫细胞能快速识别外界抗原并做出免疫应答,提高肝脏的免疫机能;另一方面,饲粮蛋白质水平高低会影响肝脏的基因表达模式,进而影响肝脏的免疫功能,本研究中补饲开食料提高饲粮蛋白质水平,增强肝脏的免疫机能,这与王波[25]低蛋白饲粮影响肝脏发育的研究结果相一致。

据报道,营养缺乏或不足会影响免疫功能,而适当补充营养在一定程度上能够调控由于营养缺乏而导致的免疫功能下降[26]。IgA是黏膜免疫的主要抗体[27];IL-2是一种炎性因子直接作用于B细胞发挥其免疫功能[28];IL-4生物效应最高的抗炎因子,促进B 细胞的增殖[29];TNF-α是一种促炎因子,脂多糖(LPS)是其刺激剂[30]。本研究中,与断奶前的160日龄结果不同,230日龄(断奶后)对照组牦牛犊牛肝脏IgA、IL-2和IL-4含量增加,分析原因可能存在两个方面,其一,断奶后给对照组牦牛犊牛补饲精料(断奶前没有),精料在瘤胃内发酵产生挥发性脂肪酸等,使瘤胃pH下降,黏膜受损通透性增加[31],LPS等抗原进入瘤胃壁毛细血管激活粘膜免疫,产生IgA等细胞因子,经血液循环到达肝脏后激活免疫功能,使得肝脏中促炎因子和抗炎因子的含量增加,增强肝脏的免疫功能,这与LPS调节反刍动物肝脏免疫功能的影响结果一致[32],肝脏受到门静脉的LPS 刺激时,TNF-α的产生会加强,表明肝脏参与反刍动物的免疫调节,这与本试验的研究结果一致[33]。 其二,在营养限制期间动物体对营养素的代谢需求降低,动物的基础能耗减少,以提高动物在一定时间内对低营养饲养条件下的适应能力,待补充饲料采食恢复营养后,其器官如肝脏、胃肠道等会补偿生长,其功能也会随之增强[34],提高饲粮蛋白质和能量水平能促进肝脏细胞增殖分化和补偿生长[35],以上结果与本试验补饲开食料提高饲粮蛋白质和能量水平促进肝脏发育的研究结果相一致。

3.3 补饲开食料对牦牛犊牛胸腺发育的影响

胸腺是机体主要的中枢免疫器官,其发育和生理机能完善对机体非常重要。胸腺不仅参与细胞免疫对机体起保护作用,而且其皮质中含大量的胸腺细胞,分泌胸腺肽等激素促进T细胞分化成熟,增强细胞免疫功能并调节机体免疫平衡[36-37]。本试验中,补饲开食料提高了 断奶前(160日龄)和断奶后(230日龄)的牦牛犊牛胸腺皮质厚度和皮质/髓质比例,同时促进胸腺细胞的发育和胸腺肽的分泌,提高机体的细胞免疫机能,这与妊娠后期宫内限制影响蒙古羊胎儿胸腺发育的研究结果一致[38]。同时研究也发现,蛋白质和氨基酸水平较低时小鼠胸腺上皮褪化,重新给予正常蛋白水平的饲粮能够促进胸腺细胞发育使胸腺恢复正常[39],这与本试验补饲开食料提高饲粮蛋白水平促进牦牛犊牛胸腺的发育的研究结果一致,且推测营养的供给可能会持续影响胸腺的发育和免疫机能。本试验中补饲开食料断奶前(160日龄)和断奶后(230日龄)牦牛犊牛胸腺细胞因子水平接近一致,说明补饲开食料提高饲粮蛋白质和能量水平对胸腺发育和其分泌的激素影响显著,但对胸腺分泌的细胞因子含量未见明显影响,但这方面的相关报道现在还很少,有关于补饲开食料影响牦牛犊牛胸腺发育和免疫的机理还有待进一步研究。

3.4 补饲开食料对牦牛犊牛脾脏发育的影响

脾脏参与机体内所有的免疫应答,同时还兼具滤血、造血等功能[40]。IFN-γ是一种具有广泛高效抗病毒和免疫调节作用的细胞因子, 能直接增强NK细胞杀伤病毒的能力, 它的分泌受到机体的严格调控。在免疫状态下, IFN-γ的表达会出现变化[41],脾小结数量增多且体积变大时机体发生体液免疫应答[42]。本试验发现,补饲开食料提高断奶前(160日龄)牦牛犊牛脾脏脾小结半径和IFN-γ含量,促进脾脏的发育和细胞因子的合成,且由瘤胃壁毛细血管进入脾脏的细菌LPS刺激脾脏完善脾脏功能,抵御不良反应,这与钟友宝[43]的研究结果一致。且研究表明高水平纤维饲粮会促进脾脏的发育[44],与本试验中补饲开食料提高日粮纤维水平促进脾脏发育的研究结果一致。补饲开食料提高饲粮蛋白水平促进脾脏的发育,这与岳喜新[45]研究结果一致。

免疫器官对营养水平的敏感性不同,从免疫系统的角度出发,中枢免疫器官有利用营养物质的优先权,相对不易受到营养水平的影响,营养水平的高低对外周免疫器官的影响较大[46],牦牛犊牛断奶后,饲粮组成和营养水平一致,导致两组外周免疫器官脾脏的发育和细胞因子含量未见明显差异,肝脏中的炎症介质,如LPS等抗原和代谢物则通过循环系统影响脾脏的功能[47]。本试验中230日龄牦牛犊牛对照组和试验组的肝脏细胞因子水平未见明显变化,据推测可能是炎性介质经过肝脏的代谢,不足以影响脾脏细胞因子的变化,影响脾脏的免疫功能。

4 结 论

补饲开食料提高断奶前后牦牛犊牛的生长性能,且提高断奶前牦牛犊牛的免疫力,对断奶后牦牛犊牛免疫器官的发育存在潜在积极调控作用,故对牦牛犊牛早期适时合理补饲是有必要的。