雷帕霉素抑制口腔鳞癌细胞增殖及其分子机制研究

焦会杰

口腔鳞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是严重危害人类健康的口腔疾病，其发病率呈逐年上升趋势[1，2]。全球范围内OSCC 占所有新发癌症病例的4%～7%[3]。据统计，口腔鳞癌占口腔癌的90%以上[4]，加强对口腔鳞癌的研究在我国具有重要的理论和现实意义。临床上对于OSCC 的治疗以手术为主辅以放化疗的综合治疗，近年来OSCC的治疗取得了很多的创新和改革，但患者的5 年生存率仍不超过60%[5]。OSCC 细胞比一般肿瘤细胞更容易发生转移，因此研究药物对于OSCC 的治疗和预防具有重要意义。目前大量实验研究表明：OSCC的发生涉及多因素、多环节、多阶段的复杂过程，由于大量基因表达的异常，致使分子代谢异常及细胞正常生理过程发生改变，转导相关信号受阻，细胞结构改变、免疫调节紊乱及细胞增殖等异常[6～8]。

雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）特异性抑制剂,多样性的生物活性，具有抗肿瘤、免疫抑制、抗真菌、保护神经及抗老化等众多作用[9，10]。研究证实mTOR 的靶蛋白参与细胞生命活动的重要过程，mTOR 信号通路则在细胞分化、增殖、存活和转移中扮演着重要的角色。雷帕霉素通过抑制mTOR 与下游靶蛋白之间的相互作用，而呈现出抑制肿瘤细胞的作用[11]。随着相关研究的不断深入，人们发现PI3K/AKT/mTOR 信号转导途径在肿瘤的产生和发展过程中地位显著[12，13]。mTOR 作为平衡细胞生长的重要调节因子，在维持细胞生理状态和应对外部环境压力的过程中起着至关重要的作用，mTOR 的抑制剂可以通过mTOR 相关信号通路对肿瘤细胞的生长发挥调控作用[14～17]。目前，雷帕霉素临床上主要用作免疫抑制剂及抗肿瘤药物。它多样性的生物活性极大激发了科研工作者对其作用机制的研究兴趣。因此本实验探讨雷帕霉素对口腔鳞癌细胞 SCC-4 增殖的抑制作用并探讨其作用机制，为雷帕霉素防治口腔鳞癌提供临床前研究依据。

材料与方法

1.材料与仪器

口腔鳞癌细胞株SCC-4，购自美国ATCC 公司；雷帕霉素，购自美国Selleck 公司；兔抗人P-S6K1单克隆抗体，购自天津三箭生物技术股份有限公司；辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG，购自北京中杉金桥生物有限公司；兔抗人p-AKT 单克隆抗体、兔抗人p-STAT3 单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记抗兔IgG，均购自泊湾生物技术有限公司；B7 同系物（B7-H1)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒，购自武汉基因美生物技术股份有限公司。PM-10A 荧光倒置显微镜购自日本Olympus 公司、5414D 离心机购自德国EPPENDORF 公司、SUAAISETIV 酶标仪购自奥地利TECAV 公司、AX-80 多功能显微镜购自日本Olympus 公司、IQLAS400 化学发光成像分析仪等均购自美国通用电气医疗集团公司。

2.方法

（1）MTT 法测定雷帕霉素对SCC-4 增殖作用的影响：取对数生长期的SCC-4 细胞，先用胰酶消化，再制成SCC-4 的单细胞悬液，调整细胞数为2×104/mL，按照200 μL/孔接种于96 孔板中。实验分为空白组（无SCC-4，仅DMEM 培养基）、对照组（0 μmol/L 雷帕霉素）及不同浓度（20、40、80 μmol/L）的雷帕霉素给药组,每组设4 个复孔。SCC-4 细胞与药物作用24 h 后,加入MTT 溶液（5 mg/ml）20 μL,继续孵育4 h,弃掉培养基。每孔加入DMSO 150 μL，振荡器振荡10 min 溶解甲结晶。在酶联免疫检测仪上选择570 nm 波长，测定各孔光吸收值，记录结果。计算细胞的抑制率,公式为：抑制率（%）＝1-（处理组平均吸光度值-空白组平均吸光度值）/（对照组平均吸光度值-空白组平均吸光度值）×100%。

（2）Western blot 检测相关蛋白的表达：实验组使用剂量为80 mol/L 雷帕霉素干预SCC-4 细胞株24 h，空白对照组SCC-4 细胞株在相同环境下未作干预24 h 后，分别收集细胞、提取细胞总蛋白。按照BCA 蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量。利用蛋白印迹（Weastern Blot）技术，以细胞浆中的p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 为抗原，分别以兔抗人p-S6K1 单克隆抗体、兔抗人p-AKT 单克隆抗体、兔抗人p-STAT3 单克隆抗体作为第一抗体，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 为第二抗体，内参基因为管家基因GAPDH。分别取SCC-4 细胞蛋白样品40 μg，经过Tris-HCl 凝胶电泳分离后，转至PVDF膜（0.45 μm）上，5%脱脂牛奶封闭1 h 后，将兔抗人p-S6K1 单克隆抗体、兔抗人p-AKT 单克隆抗体、兔抗人p-STAT3 单克隆抗体稀释，比例为1:1000，兔抗人GAPDH 单克隆抗体稀释，比例为1:3000。混合充分放入密封袋中。将经过漂洗的PVDF 膜分别放入对应的一抗中，4℃过夜。TBST 漂洗5 次，5 分钟/次。用TBST 稀释辣根酶标记山羊抗兔IgG，比例为1:2500。混合充分放入密封袋中（注：四种蛋白用同一种二抗）。将经过漂洗的PVDF 膜置入密封袋中，室温，继续孵育1 h。用TBST 清洗3 次，每次10 min，ECL 显色后，以管家基因GAPDH 作为内参基因，利用Image Quant LAS4000 化学发光成像分析仪曝光PVDF 膜上条带图像并储存。用Quantity One 图像分析软件记录内参条带与目的条带灰度值，并计算细胞SCC-4 中p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 的相对蛋白表达量。

（3）酶联免疫吸附法（ELISA）检测共刺激分子（B7-H1）的变化情况：取处于对数生长期的SCC-4细胞,先用胰酶消化，再制成细胞数为5×105/mL，并以1 mL/孔接种于6 孔板。当细胞贴壁、生长至70%，收集细胞培养液，8000 r/min 离心5 min。离心沉淀之后即刻检测，小试管准备7 只，按照说明书指示稀释标准品。稀释后各管浓度依次为：1000 pg/ml,500 pg/ml,250 pg/ml,125 pg/ml,62.5 pg/ml,31.25 pg/ml，15.63 pg/ml。分别设空白孔（空白孔不加酶标试剂、样品及生物素标记的抗B7-H1 抗体）、待测样品孔（每个样本设立3 个复孔）、标准品孔。每孔加入300 μl 1×洗液静置浸泡30 s。弃掉洗液，在吸水纸上将微孔板拍干。每孔加入50 μl 1×检测缓冲液，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品50 μl，标准孔加入50 μl 倍比稀释的标准品，然后每孔再加稀释后生物素标记的抗B7-H1 抗体50 μl。用封板膜封板后，300 转/分钟振荡，室温孵育2.5 h。弃掉液体并甩干，并每孔洗涤液添加300 μl，静置30 s后弃掉并在吸水纸上拍干，此步骤重复6 次。每孔酶标试剂添加100 μl，空白孔除外。使用新的封板模封板，300 转/分钟振荡，室温孵育1 h。洗涤，弃掉洗液，在吸水纸上将微孔板拍干。每孔显色底物TMB 添加100 μl,震荡混匀，并在37 ℃避光环境中显色15 min。每孔终止液加入100 μl 终止反应。空白孔为零点，以波长为450 nm 依次测量各孔OD值（吸光度）。为保证实验数据准确性，测定步骤应在加入终止液后30 min 以内进行。横坐标为标准品的浓度，纵坐标为OD 值，并绘制标准曲线，算出标准曲线的直线回归方程。将样品的OD 值代入方程式，就能算出每个样品的实际浓度。使用80 μmol/L的mTOR 抑制剂雷帕霉素干预SCC-4 细胞株，采用ELISA 检测干预24 h 后其下游共刺激分子（B7-H1）的变化情况。

3.结果分析和相关统计学方法

本研究运用统计分析软件SPSS13.0 对数据进行统计学处理。实验结果采用单因素方差分析，当P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

结果

1.MTT 结果显示雷帕霉素可以显著抑制口腔鳞癌细胞SCC-4 的增殖，且呈剂量依赖性。

不同浓度雷帕霉素对SCC-4 增殖的影响（结果如图1 所示），随着雷帕霉素给药浓度增大，SCC-4细胞增殖的抑制率依次升高。当雷帕霉素作用24 h，浓度为20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 时，SCC-4 细胞抑制率分别为8.2%、17.8%、36.7%，表明高剂量（≥80 μmol）雷帕霉素对SCC-4 细胞具有明显的抑制作用，因此选择80 μmol/L 对细胞抑制率较为明显的剂量作为雷帕霉素的给药剂量进行下一步的研究。

图1 不同浓度雷帕霉素对口腔鳞癌SCC-4 细胞增殖的影响

2.雷帕霉素对细胞增殖相关蛋白表达的影响

80 μmol/L 雷帕霉素给药干预后检测p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 等蛋白的表达情况。Western Blot检测结果与对照组比，雷帕霉素给药组的p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 等蛋白的表达均下降（结果如图2所示），其差异有统计学意义（P＜0.05）（结果如表1所示）。表明雷帕霉素能够抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关蛋白p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 的活化从而对SCC-4 细胞增殖具有抑制作用。

表1 WB 检测80 μmol/L 雷帕霉素给药干预前后口腔鳞癌SCC-4 细胞中的p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 蛋白的相对表达量

图2 WB 检测80 μmol/L 雷帕霉素给药干预前后口腔鳞癌SCC-4细胞中p-AKT、p-STAT3 及p-S6K1 蛋白的相对表达量,*号表示其差异有统计学意义（P＜0.05）

3.雷帕霉素对细胞共刺激分子的影响

80 μmol/L 雷帕霉素给药干预后检测共刺激分子（B7-H1)的浓度变化情况。ELISA 结果显示使用80 μmol/L 的雷帕霉素给药后，SCC-4 细胞株共刺激分子（B7-H1) 浓度均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（结果如图3、表2 所示）；表明雷帕霉素能够降低PI3K/AKT/mTOR 信号通路下游相关共刺激分子（B7-H1)的浓度，从而抑制鳞癌细胞增殖。

表2 80 μmol/L 雷帕霉素给药干预前后口腔鳞癌SCC-4 细胞中B7-H1 浓度

图3 80 μmol/L 雷帕霉素给药干预前后口腔鳞癌SCC-4 细胞中B7-H1 浓度的直方图，*号表示其差异有统计学意义（P＜0.05）

讨论

口腔鳞癌是严重危害人类健康的口腔疾病，其发病率呈逐年上升趋势[18～20]。据统计，中国OSCC 的发病率明显高于其他国家[21，22]。因此，加强OSCC 的研究具有重要的医学意义。尽管手术和辅助治疗方面取得了一定的进展，但OSCC 患者的预后仍很差，主要原因是诊断晚、生存率低、局部复发和预后不良。因此，迫切需要探索口腔鳞癌发生发展的机制，完善口腔鳞癌的治疗和管理策略。本研究以口腔鳞癌SCC-4 为研究对象,主要探究雷帕霉素对鳞癌细胞的影响和作用机制，为雷帕霉素防治口腔鳞癌提供临床前研究依据。

雷帕霉素（mTOR）抑制剂的机制靶点是来自吸水链霉菌的大环内酯类抗生素，可阻止T 淋巴细胞活化和B 细胞分化,具有抑制肿瘤、抑制机体免疫、抗真菌、保护神经及抗老化等众多作用[23，24]。由于mTOR 调控许多下游通路，mTOR 抑制剂可以影响这些通路来控制各种疾病。其中PI3K/AKT/mTOR通路就是细胞内至关重要的信号转导通路,在细胞的生长、存活、增殖和凋亡等过程中扮演着极重要的生物学角色[25]且对多种肿瘤具有抑制作用。信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是该通路最重要的一个调节因子，STAT3 蛋白是决定肿瘤微环境中免疫反应向着肿瘤形成还是抑制方向发展的关键因素[26]，STAT3 参与了肿瘤细胞和机体免疫系统的相互作用，活化的STAT3 能降低机体免疫系统对肿瘤细胞的监视和杀伤功能，从而为肿瘤细胞的生长提供便利条件[26]。本实验将80 μmol/L 雷帕霉素作用于口腔鳞癌细胞24 h,抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路，发现该调节因子的磷酸化水平较对照组明显降低。

AKT 是PI3K/AKT 信号通路的中心调节效应分子。利用Weastern Blot 检测雷帕霉素作用于SCC-4后,发现AKT 蛋白磷酸化水平降低，表明雷帕霉素作用后，PI3K/AKT 信号通路在一定程度上被抑制[27]。

B7-H1 可在肿瘤细胞和肿瘤组织树突状细胞上表达,并在诱导特异性T 细胞凋亡和肿瘤免疫逃逸过程中发挥重要作用。虽然人的正常组织中表达B7-H1 的转录产物，但却很难检测到B7-H1 蛋白的表达。相反在大多数实体肿瘤中可以检测到B7-H1蛋白的高表达，提示可能在肿瘤发生的某一阶段B7-H1 的转录后翻译过程明显增加[28]。Parsa 等研究表明神经胶质瘤中抑癌基因的缺失调控PI3K/AKT/mTOR 信号下游的核糖体蛋白S6 激酶1（S6 kinase 1，S6K1）通路实现对B7-H1 基因翻译水平的调控,导致B7-H1 蛋白表达增加,从而促进肿瘤免疫逃逸[29]。利用酶联免疫吸附法检测雷帕霉素作用于口腔鳞癌后，发现B7-H1 的表达降低，表明雷帕霉素在一定程度上抑制了鳞癌细胞的免疫逃逸。

综上所述，本研究的结果证实雷帕霉素通过调节PI3K/AKT/mTOR 信号通路的关键因子，抑制口腔鳞癌细胞SCC-4 增殖，并表现出浓度依赖性的抗肿瘤作用。雷帕霉素引起共刺激分子（B7-H1)的表达降低，进而降低鳞癌逃避机体免疫监视，从而抑制鳞癌细胞增殖。此外，下调信号通路PI3K/AKT/mTOR 相关蛋白的表达可能是雷帕霉素抑制口腔鳞癌细胞免疫逃逸的机制之一,雷帕霉素可下调凋亡相关p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 蛋白磷酸化水平，这可能是促进肿瘤细胞凋亡的机制之一。本研究结果表明雷帕霉素对于防治口腔鳞癌具有一定应用研究价值。为口腔鳞癌防治提供新的理论基础，为雷帕霉素在口腔鳞癌及其他恶性肿瘤的临床应用提供了实验依据。为其进一步应用于临床提供理论依据。