两株生防菌对华重楼主要病害的防效试验

廖承树，罗晓锋，岳 滨，黄燕梅，叶 炜，乔 锋，周建金*

（1.三明市农业科学研究院，福建三明 365509；2.宁化县林业局，福建三明 365400）

华重楼[Paris polyphyllavar.Chinensis（Franch.）Hara]主产于我国长江以南海拔500～1000 m 山区，喜阴凉湿润气候，是片仔癀、宫血宁、云南白药等名贵中成药的主要成分。随着重楼止血、抗病毒、抗肿瘤等药理作用的不断挖掘，应用范围越来越广，以致野生资源供不应求。人工种植由于生境改变，密度大，定植后灰霉病、根腐病、茎腐病等病害发生严重，常造成种植户的巨大损失。传统的化学农药防治，存在农药残留影响中药材品质和安全、环境污染和病菌易产生抗药性等问题。生防菌防治植物病害，具有安全绿色等特点，但常用的生防菌剂多为单株菌剂，容易出现防效不稳定的情形[1]，且鲜见应用于华重楼病害防治的报道。本试验拟用2 株生防菌复配，用于华重楼主要病害的防治，以期取得较好的防治效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株和华重楼品种

生防菌株T2-1、生防菌株HG、灰霉病病原灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）菌株CLG1、根腐病主要病原尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）菌株N3-1、茎腐病病原胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）菌株C1-1 均由三明市农科院药用植物研究所分离保存；供试华重楼品种分别为福建省永安市大坪、宁化县牙梳山野生驯化华重楼。

1.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基用于细菌培养；LB液体培养基，pH 值7.0～7.2，用于细菌扩繁和生防菌株的分子生物学鉴定。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），用于真菌培养和对峙试验（pH 值7）；PDA（冷却到45 ℃左右）中添加（0.05 g 链霉素+0.25 g 氯霉素）·L-1培养基，用于分离土壤真菌[2]；PD 液体培养基用于真菌扩繁。

1.2 试验方法

1.2.1 生防菌的分离与鉴定

生防菌株T2-1、HG 从华重楼根系土壤分离获得，方法为采集病害较重田块里长势良好的华重楼距离畦面5～10 cm深的根系土壤，混合拌匀。采用10倍稀释法，即取10 g土样加入90 mL无菌水中，以160 r·min-1在摇床上振荡30 min，制备10-1的土壤初悬液，吸取1 mL初悬液于9 mL 无菌水中，制成稀释度为10-2的土壤悬浮液，以此类推，逐级制备稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤悬液。用移液枪分别吸取100 µL 稀释度为10-1、10-2、10-3的土壤悬液，分别均匀涂布在添加链霉素和氯霉素的PDA 培养基上，置于28 ℃恒温培养箱倒置培养，3 d 后分别挑取菌落边缘的菌丝，接种至新的PDA 培养基上，重复5～6次，得到纯化菌落，4 ℃保存备用；分别吸取100µL稀释度为10-4、10-5、10-6的土壤悬液，分别均匀涂布在营养琼脂培养基，37 ℃培养24 h 后，挑取生长完整的单菌落进行纯培养得到单菌株，4 ℃保存备用。以上分离到的菌株，再分别与灰葡萄孢菌株CLG1、尖孢镰刀菌株N3-1、胡萝卜软腐果胶杆菌菌株C1-1 进行平皿对峙试验，选取抑菌性能良好的菌株，进行华重楼离体叶片创伤感染试验，无致病性的菌株进一步进行形态学观察、分子生物学鉴定。

形态学鉴定：拮抗细菌参照《常见细菌系统鉴定手册》[3]，初步鉴定并保藏；拮抗真菌光学显微镜下观察菌丝形态、子实体形态、颜色等特征，参照《真菌鉴定手册》[4]，初步确定菌株的分类地位并保藏。

分子生物学鉴定：将纯化后的T2-1、HG 菌株分别接种于LB 液体培养基培养过夜，采用CTAB 法提取菌株DNA，菌株T2-1利用细菌通用引物27 F(序列5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492 R(序 列5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)进行16S rDNA 的ITS 片段PCR 扩增；菌株HG 利用真菌通用引物ITSl（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ ），ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR 扩增真菌18S rDNA 的ITS 片段。20 µL PCR 反应体系为：2 ×Taq MIX 10µL，上、下游引物各1µL，菌株DNA 2µL，双蒸水补至20µL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，引物54 ℃退火温度下复性30 s，72 ℃延伸40 s，共40 个循环后，72 ℃延伸10 min，PCR 产物于4 ℃下保存。利用浓度为1%琼脂糖电泳，分别回收1400 bp、500 bp 左右的条带，送铂尚生物技术有限公司测序。测序结果在GenBank 数据库进行BLAST比对。利用MEGA 6.0 软件进行系统发育分析，采用最大似然法（Maximum Likelihood）、邻接距离法（Neighbor-Joining）构建系统进化树。

1.2.2 菌种扩繁与种子液、生防菌剂制备

挑取营养琼脂培养基活化后的菌株T2-1 单菌落，在LB 液体培养基中28 ℃160 r·min-1振荡培养24 h，制成种子液。种子液按1∶10接种到LB 液体培养基中28 ℃160 r·min-1震荡培养36h，调整成浓度为2×109cfu·mL-1的菌悬液；菌株HG 在PDA 活化，取直径6 mm 的菌落边缘菌饼5 个，加入装有100 mL PD 液体培养基的250 mL 三角瓶中，28 ℃130 r·min-1振荡培养48 h，制成种子液。种子液按1∶10 接种到PD 液体培养基中，28 ℃130 r·min-1振荡培养7～10 d，双层纱布滤去菌丝，血球计数板计数，调整孢子浓度，制成2×109个·mL-1的孢子悬液。上述菌株T2-1 菌悬液、菌株HG 孢子悬液按1∶1 等体积混匀，制备成两种生防菌含量均为1×109cfu·mL-1的生防菌混合液（以下简称“生防菌剂”）。

1.2.3 生防菌菌株相容性试验

菌株T2-1 菌悬液用无菌水稀释10 倍，用无菌小喷壶把均匀喷至PDA 平板（pH 值7）表面，用移液枪吸取菌株HG 孢子悬液10µL，分别点接在距平板中心2 cm 的对称两点，28 ℃培养，设3 个重复，观察抑菌圈等情况。

1.2.4 生防菌剂抑制病原菌平皿对峙试验

取直径6 mm 刚活化的病原菌灰葡萄孢菌CLG1 菌落边缘菌饼，接种于PDA（pH 值7）平板中央，用移液枪在距菌饼2 cm的4个点等距离各点接生防菌剂50µL，以不加生防菌剂为对照，每个处理3 次重复，倒置培养。4 d后用“十”字交叉法测量菌落直径，计算各处理的抑菌率。

尖孢镰刀菌N3-1的试验方法同灰葡萄孢菌CLG1。

用移液枪吸取胡萝卜软腐果胶杆菌C1-1 菌悬液200µL，滴至PDA（pH 值7）平板中央，用无菌玻璃涂布棒均匀涂布在PDA 平板表面。用移液枪在距平板中央2 cm 的等距离4 个点各点接生防菌剂50 µL，每个处理3 次重复，以不加生防菌剂为对照，倒置培养5 d，测生防菌菌落抑菌圈大小。

1.2.5 生防菌剂抑制病原菌防效小区试验

由于华重楼是中高海拔多年生植物，盆栽试验难度较大，一般不做。小区试验自2021 年2 月15 日至6月15日，在永安市洋峰华重楼示范基地进行。该基地海拔1020 m，种植面积1.33 hm2，品种为永安市大坪野生驯化华重楼，土壤改良及底肥、追肥处理方法为：上述生防菌剂2 L 稀释，均匀喷洒到1 t 华重楼专用肥（腐熟羊粪、腐熟菌渣1∶1 混合）中，混匀。底肥按3 t/667 m2撒到田土表面，混耕；追肥为0.5 t/667 m2，每年12月、4月两次施用。将生防菌剂稀释成一定浓度后喷施、冲施。处理1为生防菌剂浓度3×106cfu·mL-1，全株喷施，每10 d 根基部冲施10 mL/株1 次；处理2 为生防菌剂浓度5×106cfu·mL-1，全株喷施，每15 d 根基部冲施10 mL/株1 次；处理3 为生防菌剂浓度8×106cfu·mL-1，全株喷施，每20 d 根基部冲施10 mL/株1 次；以不施生防菌（基肥、追肥不添加生防菌剂，不喷施、不冲施生防菌剂）作为对照。以上每处理3 m2，重复3次，观察结果。

1.2.6 生防菌剂抑制病原菌田间试验

田间试验自2022 年3 月1 日至5 月19 日，在宁化县安远镇兰秀家庭林场进行。该场海拔530 m，华重楼种植面积20 hm2，品种为宁化县牙梳山野生驯化华重楼，土壤未改良，不施肥。2020 年该场曾发生严重的灰霉病，导致种子基本绝收，根腐病、茎腐病较为严重。2021年用多菌灵+百菌清喷雾，效果不够理想，仍有近20%的发病率；通过挖深畦沟，促进排水，根腐病有一定程度缓解。由于病害较为严重，试验设计为：在该场随机选取2021 年发病情况基本类似的4 地块，分别作为生防菌处理1、生防菌处理2、农药处理组、不处理（对照），每个处理33 m2，重复3 次。处理1 以生防菌剂按5×106cfu·mL-1浓度全株喷施，根基部冲施10 mL·株-1，3 月1 日起每15 d 冲施1 次，共4次；处理2 以生防菌剂按5×107cfu·mL-1浓度全株喷施，根基部冲施10 mL·株-1，3 月1 日起每15 d 冲施1次，共4 次；农药处理组用25%嘧菌酯60 mL/667 m2叶片、花器喷雾，4 月1 日起每15 d 冲施1 次，共2 次（除试验地块外，其余地块均为此方法处理）；以不施生防菌剂作为对照（CK）。观察、统计以上处理结果。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2016 进行整理，采用SPSS 23.0软件的Duncan新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 生防菌的鉴定结果

形态学鉴定结果：菌株T2-1菌落边缘整齐，表面凸起有褶皱，奶白色，半透明，革兰氏染色阳性，杆状，内有芽孢，卵圆形，位于菌体中央或稍偏，需氧，吲哚试验阳性，可还原硝酸盐，硫化氢试验、V.P试验阴性，参照《常见细菌系统鉴定手册》[3]，初步判定为芽孢杆菌；HG 菌株培养7 d 后，菌落由白色变为暗绿色，菌丝有分隔，分生孢子梗无色，2～3 次分枝，第1分枝近直角，小梗着生分生孢子的小梗瓶形，分生孢子圆形，淡绿色，参照《真菌鉴定手册》[4]，初步判定为木霉菌。

分子生物学鉴定结果：T2-1进行PCR扩增，得到了长度为1455 bp 的16S rRNA 基因片段，将序列在NCBI 上进行核苷酸同源性比对，结果显示，与Bacillus_ methytrophicus_zzx25 同源性最高为99.93%，用最大似然法构建的系统发育树如图1 所示，与Bacillus_methytrophicus_zzx25共聚为一支。

图1 菌株T2-1的系统进化树

HG扩增得到长度为620 bp的18S rDNA基因片段，序列NCBI 比对结果，与Triichoderma harzianum isolate AHRS 同源性最高为99%，用邻接法构建的系统发育树如图2 所示，与Triichoderma harzianum isolate AHRS共聚为一支。结合形态学和分子生物学鉴定结果，T2-1为甲基营养型芽孢杆菌，HG为哈茨木霉菌。

图2 HG的系统进化树

2.2 生防菌菌株相容性试验结果

哈茨木霉菌HG 菌落与甲基营养型芽孢杆菌T2-1菌落相容性好，未见抑菌圈。这一结果表明，甲基营养型芽孢杆菌T2-1 和哈茨木霉菌HG 具有良好的相容性，可以发挥各自的特点，协同抑制病原菌。

2.3 平皿对峙试验结果

平皿对峙试验结果显示，生防菌剂对华重楼主要病原真菌灰葡萄孢、尖孢镰刀菌的抑菌率在78%以上（见表1）；对重楼主要病原细菌胡萝卜软腐果胶杆菌的抑菌圈直径为15.5 mm，孔径为6 mm，抑菌直径为9.5 mm。试验结果表明，生防菌剂在室内平皿对峙试验中，对华重楼主要病害的病原均具有较好的抑制作用。

表1 生防菌剂对灰霉病菌、尖孢镰刀菌的平皿对峙结果

2.4 小区试验结果

各小区处理防效达50%以上（见表2），与对照之间差异显著，说明生防菌剂对华重楼主要病害防治有效；处理1、2 与处理3 结果差异显著，说明防治效果与生防菌剂浓度具有相关性，浓度较高，效果较好；处理1 与处理2 结果差异不显著，可能是生防菌浓度较低，虽然施用生防菌剂时间间隔更短，防效并没有较大提升。

宠物猫在宋人生活中就更为常见了。吴自牧《梦粱录》记载：“猫，都人畜之捕鼠。有长毛，白黄色者称曰‘狮猫’，不能捕鼠，以为美观，多府第贵官诸司人畜之，特见贵爱。”宋人将家猫分为两大类：捕鼠之猫、不捕之猫。猫不捕鼠而受主人“贵爱”，当然是将猫当成宠物养了。

表2 生防菌剂不同浓度、不同施用时间间隔的防治效果

2.5 田间试验结果

试验结果显示处理1、处理2与对照之间差异显著（见表3），表明在病害较为严重的田间，生防菌防治华重楼主要病害仍然具有较好效果；两个处理之间防效差异显著，表明在病害较为严重的田间，加大生防菌浓度，可显著提高防效。生防菌剂浓度差距如果缩小，或浓度减小、间隔时间同时缩短，是否仍有较好效果，值得探讨。但与新型农药嘧菌酯对灰霉病的防效相比，新型农药嘧菌酯的防效明显好于生防菌，差异显著，且用量、施用次数少，具有明显优势，这也是生防菌防治在农户中较难推广的原因之一。

表3 不同浓度生防菌剂的田间防效比较

与小区试验结果相比，田间试验处理中，根腐病发病率较高，相同浓度处理两者结果相差将近3 倍，可能与田间试验土壤未经改良处理有关。与小区对照相比，田间对照发病率较低。可能是经过两年的流行，植株获得一定程度的抗性。

3 讨论与结论

3.1 讨论

华重楼灰霉病为半知菌亚门灰葡萄孢属灰葡萄孢菌引起的病害，低温高湿季节高发（20～25 ℃、湿度90%以上易暴发，＞32 ℃或＜2 ℃不易发病[5]），以4月、5 月初为害最为严重。灰霉病传播迅速，分生孢子随风、雨、昆虫和农事操作等传播扩散，从伤口、自然孔口感染或从表皮直接侵入，病部产生的分生孢子可再侵染，循环多次，加重病害。外轮花被、果实、叶、茎秆均能受害，以外轮花被片、果实的症状最为明显，常导致花器腐烂，种子绝收。该病病原以菌丝、分生孢子、菌核在病残体或土壤中越冬，翌年条件合适时，菌核萌发产生菌丝体和分生孢子，开始新的侵染周期。

华重楼根腐病主要由尖孢镰刀菌所致的病害，高温高湿多发，雨水、积水可促进传播，根茎创伤（线虫、昆虫、农事操作等引起）后易感。发病早期地上部无症状，发病中期根部开始腐烂，导致植株吸收水分和养分的功能逐渐减弱，地上部叶片出现萎蔫，夜间又能恢复。后期随着根茎腐烂加剧，地上部逐渐枯死。华重楼茎腐病是由胡萝卜软腐果胶杆菌引起的华重楼细菌性病害，高温多雨季节多发。发病初期茎基部出现水渍状病灶，并外溢黏稠汁液，后期液化，有恶臭。病原可由维管束传输，引起茎秆倒伏，叶片萎蔫，块茎腐烂。传统上使用化学农药防治植物病害，但化学农药易产生抗药性。嘧霉胺（施佳乐）1994 年在法国获得登记，仅仅两年后就发现了抗药菌株[6]。此外，农药施用后在土壤中的残留量高达50%～60%，且不易降解，造成环境污染与生态破坏，影响人类健康[7]。

土壤有益微生物，尤其是根表有益微生物可作为植物抵抗土壤病原菌侵染的第一道防线，也是植物免疫系统的重要组成部分[14]。生防菌快速定殖，是提高其对土传病害防治效果的重要因素之一[15]。土壤的理化性状和微生态环境对生防菌定殖和生长具有重要影响。在小区试验中，由于结合土壤改良，对根腐病的防治效果较田间试验结果理想。分析其原因，可能是充分腐熟的羊粪和菌糠富含有机质等营养，具有很好的疏松透气性和保肥、保水性，能有效地改善土壤理化性状和微生态环境，利于需氧生防菌在土壤中定殖，形成优势菌群，提高植株防御病害能力；而在田间试验中，土壤未经改良处理，不利于生防菌的定殖和扩繁，因此防治效果低于经土壤改良的小区。

同时，还应注意到，生防菌防效会随时间递减。殷幼平等用菌株CQBSO3-pHY43G 在柑橘叶片喷雾接种后的0～15 d，生防菌在叶片上的数量呈现急剧下降趋势，然后逐渐稳定在较低水平[16]。原因可能是地上部定殖易受外界环境影响，如紫外线照射、气温、空气湿度等，以及人工喷淋雾滴粒径大，易从蜡质叶面淋失，叶背（自然孔口多于叶面）不易喷施到，影响定殖效率。

3.2 结论

从小区试验和田间试验结果可以看出，虽然生防菌防治病害取得一定成效，但与新型化学农药相比，效果和使用的方便性仍有差距，会直接影响到农户的接受度。华重楼人工种植普遍使用遮阳棚架，是否可以把生物防治与促进华重楼生长结合起来，把喷淋系统（水滴大）改成在遮阳棚架上设置自动喷雾系统（雾滴小，悬浮性好），在晴天夜晚定时喷雾促进华重楼生长，并定期用生防菌喷雾，促进生防菌与叶背、叶面充分接触，提高定殖效率，向叶片和土壤补充生防菌，避免人工喷施作业易损伤茎叶、封垄后操作困难、不易定殖（雾滴粒径过大易滑落，与叶片接触时间短）等弊端，还可在生防菌剂中加入紫外线保护剂、稳定剂等，以及结合土壤改良、减少环境不良因素影响，防止生防菌递减过快，以期保证防效的稳定性和提高施用的便利性，可在相关研究中进一步探讨。

生防菌哈茨木霉菌HG和甲基营养型芽孢杆菌T2-1 具有协同作用，对华重楼主要病害具有较好的防治效果，可用于中药材病害的绿色防控，减少农药使用和残留，提高中药材的质量，保障人类使用中药的安全。如结合土壤改良等措施，可取得更为理想的防效，具有应用于生物防治华重楼主要病害的潜力。