冠心病患者血清环状RNA人肾结核蛋白4、微小RNA-665表达与冠状动脉狭窄程度及主要不良心血管事件相关性研究

刘光姣, 王晓光, 王 焱, 王 雪, 申卫东

1.解放军总医院京中医疗区旃坛寺门诊部,北京 100034;2.解放军总医院 耳鼻喉科,北京 100039

冠心病(coronary artery disease,CAD)患者病死率位居心血管疾病首位,且随着年龄增长而增加,近年来有逐年增加的趋势。准确评估患者病情对于改善CAD患者预后具有重要意义[1-2]。非编码RNA,如微小RNA(microRNA,miRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA)等,可参与调控血管新生、动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)、血管内皮细胞增殖与凋亡等,在心血管疾病的病理机制中发挥重要作用[3]。微小RNA-655(microRNA-665,miR-665)参与肿瘤细胞的增殖、凋亡,还参与调节血管平滑肌细胞衰老[4-5]。有研究报道,在心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌组织中,miR-665表达下调,上调miR-665表达可通过调节瞬时受体电位通道M7表达改善大鼠心肌纤维化[6]。生物信息学分析(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP#!/)显示,miR-665与环状RNA人肾结核蛋白4(circular RNA human nephronophthisis 4,circNPHP4)有靶向结合位点,推测circNPHP4可能与CAD有关。而Gensini积分可有效评估患者冠状动脉狭窄程度。本研究旨在探讨CAD患者circNPHP4、miR-665表达与冠状动脉狭窄程度及主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events,MACE)的相关性。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取自2020年8月至2022年5月于解放军总医院确诊为CAD的95例患者为研究对象,并将其纳入CAD组。纳入标准:(1)符合CAD诊断标准[7],且经冠状动脉造影检查确诊;(2)首次发病。排除标准:(1)合并心肌病等其他心血管疾病;(2)既往慢性心力衰竭、心肌梗死、先天性心脏病;(3)冠状动脉移植术等治疗史;(4)合并肝肾功能不全、精神疾病;(5)合并恶性肿瘤。根据Gensini评分[8],将患者分为轻度病变组(n=39)、中度病变组(n=35)、重度病变组(n=21)。另选择同期于本院行冠状动脉造影检查未见明显病变者90例纳入对照组。本研究经本院伦理委员会批准(批准文号:2022013)。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 治疗方法 患者口服阿司匹林肠溶片治疗,首次剂量300 mg/d,病情稳定后,调整剂量为100～200 mg/d维持治疗。

1.2.2 血清circNPHP4、miR-665水平检测 采用RT-qPCR检测血清circNPHP4、miR-665相对表达量。于患者入院24 h内及对照组体检当日,采集空腹静脉血5 ml,3 000 r/min离心(离心半径10 cm),离心20 min后,收集血清,于-20℃保存。总RNA提取试剂(R1030,北京普利莱)提取血清总RNA,cDNA第一链合成试剂盒(KGA1315,江苏凯基)合成cDNA后,进行RT-qPCR扩增,引物购自金斯瑞生物科技有限公司,其中circNPHP4上游引物序列(5′-3′):GGACACATAGTGGAGAAAAG,下游引物序列(5′-3′):GGACACATAGTGGAGAAAAG;miR-665上游引物序列(5′-3′):ACCAGGAGGCTGAGGC,下游引物序列(5′-3′):GAACATGTCTGCGTATCTC;分别以GAPDH、U6为内参,采用2-△△Ct法计算circNPHP4、miR-665相对表达量。

1.2.3 随访 对所有患者进行随访,时间为6个月,记录患者MACE发生情况,包括复发性心绞痛、心肌梗死、心搏骤停、严重心律失常等。

2 结果

2.1 对照组与CAD组一般资料比较 对照组与CAD组年龄、男性比例、体质量指数、吸烟史比例、高血压比例、糖尿病比例、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇比较,差异无统计学意义(P>0.05)。CAD组高密度脂蛋白胆固醇水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 对照组与CAD组一般资料比较/例(百分率/%)

2.2 对照组与CAD组血清circNPHP4、miR-665表达水平比较 CAD组患者血清circNPHP4表达水平高于对照组,miR-665表达水平低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 对照组与CAD组血清circNPHP4、miR-665表达水平比较

2.3 不同冠状动脉病变程度患者血清circNPHP4、miR-665水平及Gensini评分比较 轻度组、中度组、重度组患者血清circNPHP4水平、血清miR-665水平、Gensini评分比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同冠状动脉狭窄程度患者血清circNPHP4、miR-665水平及Gensini评分比较

2.4 相关性分结果 CAD患者circNPHP4与miR-665呈负相关(r=-0.509,P<0.05),circNPHP4与Gensini评分呈正相关(r=0.528,P<0.05),miR-665与Gensini评分呈负相关(r=-0.648,P<0.05)。见图1。

图1 相关性分结果(a.circNPHP4与miR-665相关性;b.circNPHP4与Gensini评分相关性;c.miR-665与Gensini评分相关性)

2.5 Logistic回归分析 患者术后MACE发生率为22.11%(21/95)。多因素Logistic回归分析结果显示,circNPHP4、Gensini评分是CAD患者发生MACE的危险因素(P<0.05),miR-665是CAD患者发生MACE的保护因素(P<0.05)。见表4。

表4 Logistic回归分析

3 讨论

circRNA在心血管疾病的病理过程中发挥重要作用。有研究报道,circRNA与心肌梗死、心力衰竭、心肌炎、心脏发育等密切相关,其参与CAD的病理过程,如调节心肌细胞凋亡、细胞自噬、细胞周期与衰老、血管生成及免疫调节等多个过程[9-10]。外周血中circRNA表达常作为心血管疾病病情与预后评估的标志物,如circRNA-000864在急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI)患者中表达水平升高,是STEMI患者经皮冠状动脉介入术后发生MACE的影响因素[11]。本研究结果显示,CAD组患者血清circNPHP4表达水平显著升高,提示circNPHP4可能与CAD的发生有关。目前,有关circNPHP4的研究报道较少。circNPHP4为circRNA之一,在人表皮角化细胞和包皮成纤维细胞中可被检测。有研究报道,CAD患者血浆中circNPHP4表达显著上调,与Syntax评分呈正相关,对CAD具有良好的风险预测能力,其机制可能与circNPHP4调节冠状动脉内皮细胞粘附作用有关[12]。

miRNA可参与调节炎症反应、氧化应激、细胞自噬等过程,与CAD、AS、急性心肌梗死等心血管疾病发生有关[13]。miR-665可参与调控心肌纤维化、心肌细胞炎症反应与凋亡、肿瘤细胞迁移与侵袭等,其异常表达与多种疾病的发生相关[14-15]。有研究报道,miR-665在CAD中表达下调,上调miR-665表达可靶向调节转化生长因子β受体1表达,抑制血管平滑肌细胞增殖[16]。在氧-葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的人脑微血管内皮细胞模型中,过表达miR-665可通过抑制生长抑制因子5表达,促进OGD/R诱导的人脑微血管内皮细胞增殖并抑制凋亡[17]。本研究结果显示,CAD组患者血清miR-665表达水平低于对照组,提示miR-665水平变化与CAD发生有关;随着冠状动脉病变程度的升高,CAD患者血清circNPHP4表达水平逐渐升高,miR-665表达水平逐渐降低,提示CAD患者血清circNPHP4、miR-665水平变化与冠状动脉狭窄程度有关;相关性分析结果显示,CAD患者血清circNPHP4、miR-665表达水平呈负相关,提示circNPHP4可能靶向负调控miR-665表达参与CAD的进展。AS的形成与血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)增殖、凋亡有关。circRNA可通过海绵吸收miRNA表达,参与调节VSMCs增殖。Wang等[18]研究报道,circARHGAP32通过调节miR-665/成纤维细胞生长因子2轴,促进氧化低密度脂蛋白诱导的VSMCs增殖和迁移。由此推测,circNPHP4可能通过调节miR-665表达,调节VSMCs增殖,促进AS形成,导致CAD发生。

Gensini积分可用于评估冠状动脉病变的严重程度,CAD患者Gensini评分显著升高[19]。本研究结果显示,CAD患者血清circNPHP4表达水平与Gensini评分呈正相关,miR-665表达水平与Gensini评分呈负相关,提示circNPHP4水平越高、miR-665水平越低,冠状动脉狭窄程度越严重,检测circNPHP4、miR-665水平对判断冠状动脉病变程度具有一定的参考价值;Logistic回归分析显示,circNPHP4是影响CAD患者发生MACE的危险因素,miR-665是保护因素,提示检测circNPHP4、miR-665水平可判断患者预后,有利于对患者进行危险分层,对临床治疗具有一定的指导意义,但其临床应用仍需扩大样本量做进一步研究。

综上所述,CAD患者血清circNPHP4表达水平升高,miR-665表达水平降低。血清circNPHP4、miR-665水平与冠状动脉Gensini评分相关,是CAD患者发生MACE的影响因素,可作为评估患者病情与预后的标志物。