基于UPLC-Q-TOFMS的水栀子药材指纹图谱建立及其与栀子药材成分差异分析

刘和平 巫登菊 余孝云 郭伦 蔡信福 尚强

摘 要：建立水栀子药材超高效液相—质谱联用指纹图谱，分析水栀子与栀子药材指纹图谱的差异.采用80%甲醇超声提取，超高效液相色谱法测定指纹图谱，结合质谱、保留指数和相关文献对部分色谱峰定性鉴别；并通过相似度评价和主成分分析水栀子与栀子药材所含主要指标性成分的差异.结果显示，水栀子指纹图谱共有24个共有峰，确定了其中的14个成分.水栀子与栀子药材相似度较为一致，主成分分析可以准确区分水栀子与栀子药材.所建立的指纹图谱测定方法可以用于水栀子与栀子药材的鉴别，研究结果为水栀子与栀子药材真伪品鉴定提供了实验依据.

关键词：水栀子；栀子；指纹图谱；液相色谱；相似度；主成分分析

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

0 引 言

水栀子为茜草科（Rubiaceae）栀子属（Gardenia Ellis）栀子（Gardenia jasminoides Ellis）多个变种药材商品名的统称.经市场调研，目前市场流通的水栀子基源主要为茜草科植物大花栀子（Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.）和长果栀子（Gardenia jasminoides Ellis f.Longicarpa Z.W.Xie et Okada.）的干燥果实［1-3］.文献报道，水栀子和栀子药材均主要含有单萜（主要是环烯醚萜）、藏红花素、三萜、黄酮、香豆素、有机酸和挥发类成分等［4］，所含成分具有明显的镇痛、抗炎［5］、降血糖［6］、保肝［7］和抗抑郁［8］等药理作用或生物活性.栀子为常用中药材，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒和外用消肿止痛的功效，而水栀子现多用于提取食品黄色素，不作为中药材使用，但市场常见有水栀子药材冒充栀子药材出售.近年来，针对水栀子的单一成分的质量控制，大多集中在指标性成分栀子苷、西红花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量测定［9-11］.其他的文献报道，主要是通过药材性状、横切面显微和薄层色谱等方面对水栀子与栀子药材进行鉴别的研究［12-13］，未见有水栀子与栀子药材超高效液相—质谱联用（UPLC-Q-TOF MS）指纹图谱对比研究的文献报道.本研究通过对水栀子果实超高效液相（UPLC）指纹图谱方法的建立，研究了水栀子与栀子药材所含主要成分组成和比例差异，为今后水栀子与栀子药材基源鉴定提供数据支持.

1 材 料

1.1 仪 器

Agilent 1260型超高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），Xevo-G2-XS型四极杆—飞行时间高分辨质谱仪（沃特世科技有限公司），KQ-500VDE型双频数控超声清洗器（昆山超声仪器有限公司），MS205DU型十万分之一电子天平（梅特勒—托利多集团）.

1.2 材 料

西红花苷Ⅰ对照品（批号，111588-201303）、西红花苷Ⅱ对照品（批号，111589-201304）、栀子苷对照品（批号，110749-201316）、绿原酸对照品（批号，110753-201716）、京尼平苷酸对照品（批号，111828-201604），均购自中国食品药品检定研究院；京尼平龙胆双糖苷对照品（批号，170510）、山栀子苷B对照品（批号，170518），均购自深圳健竹生物科技有限公司;水为自制超纯水，乙腈为色谱纯和质谱纯，甲醇等其他试剂均为分析纯.从安徽宣城市（宣州区、广德县和郎溪县），以及广西玉林市水栀子人工种植基地收集了26批样品，从安徽亳州、河北安国、广州清平和江西樟树等中药材市场收集了22批不同产地的商品水栀子样品和21批栀子样品，共69批，样本收集信息见表1.所有样本的药材基原，经暨南大学药学院周光雄教授鉴定，凭证标本存于丽珠医药集团中药研究院生药资源中心.

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

取栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ、绿原酸、京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷和山栀子苷B对照品适量，加80%甲醇制成每1 mL分别含0.05、0.01、0.05、0.1、0.1、0.5和0.15 mg的溶液，即得.

2.2 供试品溶液制备

取本品粉末0.2 g，精密称定，放置三角瓶中，精密加80%甲醇50 mL，称定质量，超声提取30 min（功率500 W，频率45 KHz），取出，放冷，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，溶液过0.22 μm的微孔滤膜，取续滤液，即得.

2.3 色谱条件

液相色谱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Waters，ACQUTTY UPLC BEH-C18 ，50 mm×2.1 mm，1.7 μm）.以乙腈（A）- 0.1%甲酸水溶液（B）为流动相，按梯度洗脱.洗脱程序为：0 min，5%A；2 min，8%A；4 min，12%A；6 min，18%A；10 min，18%A；12 min，30%A；16 min，33%A；20 min，90%A.流速0.4 mL/min；进样量2 μL；柱温30 ℃；按时间变换检测波长，0～12.50 min为238 nm，12.51～20 min为440 nm.理论板数按西红花苷Ⅰ计算应不低于2 000.

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），离子源毛细管电压负离子2 kV，追孔电压35 V，碰撞能量20～50 eV，脱溶剂温度350 ℃，源温100 ℃，脱溶剂气流速800 L/hr，质量数范围50～1 500 amu，数据采集为centriod模式.

2.4 色谱条件优化

2.4.1 流动相筛选

相同条件下分别比较了不同梯度的乙腈-0.1%甲酸系统，最后确定流动相乙腈（A）- 0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脱.洗脱程序为：0 min，5%A；2 min，8%A；4 min，12%A；6 min，18%A；10 min，18%A；12 min，30%A；16 min，33%A；20 min，90%A的条件分离度最佳.

2.4.2 波长筛选

选择栀子苷最大吸收波长238 nm和西红花苷I最大吸收波长440 nm进行比较，为了能比较全面地表征水栀子药材中环烯醚萜类和西红花苷类成分，确定采取变波长的方法，即检测波长：0～12.50 min为238 nm，12.51～20 min为440 nm.

2.4.3 柱温筛选

在同一条件下，分别比较了不同柱温（25、30和35 ℃）色谱图的主要色谱峰分离度，确定柱温为30 ℃时最佳.

2.4.4 流速比较

在同一条件下，分别比较了不同流速（0.3、0.4和0.5 mL/min）色谱图的主要色谱峰分离度，确定流速为0.4 mL/min时最佳.

2.5 供试液制备方法考察

2.5.1 提取方式选择

在相同条件下，提取方式分别比较了超声提取与回流提取、超声3次与超声1次，按栀子苷、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ等12个主要特征峰计算峰面积（A）与称样量（M）的比值.结果表明，超声提取与回流提取及超声次数无明显差异，考虑操作简便，确定超声提取1次.

2.5.2 提取溶剂选择

在相同条件下，分别比较了用20%甲醇、50%甲醇、80%甲醇及100%甲醇提取，按栀子苷、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ等12个主要特征峰计算峰面积（A）与称样量（M）的比值.结果表明，80%甲醇的最佳，故确定80%甲醇作为提取溶剂.

2.5.3 提取体积选择

在相同条件下，分别比较了用25、50和75 mL的溶剂提取，按栀子苷、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ等12个主要特征峰计算峰面积（A）与称样量（M）的比值.结果表明，50 mL溶剂提取效率高于25 mL，与75 mL溶剂提取效率无明显差异，故确定提取溶剂的体积为50 mL.

2.5.4 提取时间选择

相同条件下，分别比较了超声15、30和45 min的提取时间，按栀子苷、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ等12个主要特征峰计算峰面积（A）与称样量（M）的比值.由结果可知，超声处理30 min，基本可以提取完全，故确定提取时间为30 min.

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度

取同一供试品溶液，连续进样6次，以第1针图谱为对照图谱，计算6针色谱图相似度，结果相似度均在0.999 97以上.再以西红花苷Ⅰ为参照峰，选面积相对较大的12个色谱峰，计算相对保留时间及相对峰面积的RSD值.结果相对保留时间RSD均小于0.05%，相对峰面积RSD均小于2.06%，表明仪器精密度良好.

2.6.2 稳定性

取同一供试品溶液，分别在0、1、3、6、12、24和48 h进行测定，以0 h的图谱为对照图谱，计算7个时间点色谱图相似度，结果相似度均在0.999 95以上.再以西红花苷Ⅰ为参照峰，选面积相对较大的12个色譜峰，计算相对保留时间及相对峰面积的RSD值.结果相对保留时间RSD均小于0.04%，相对峰面积RSD均小于4.17%，表明供试品溶液在48 h内稳定.

2.6.3 重复性

取同一样本粉末，按“2.2”项下方法平行制备6份样品溶液，按“2.3”方法测定.以第1份样品的图谱为对照图谱，计算6个平行样品色谱图相似度，结果相似度均在0.999 93以上.再以西红花苷Ⅰ为参照峰，选面积相对较大的12个色谱峰，计算相对保留时间及相对峰面积的RSD值，结果相对保留时间RSD均小于0.15%，相对峰面积RSD均小于1.66%，表明方法重复性较好.

2.7 样品测定与共有模式建立

取69批样本按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.3”项下色谱条件进行测定.将得到的UPLC图谱数据导入相似度评价系统（Chennind ChemPattern 2020专业版，北京科迈恩科技有限公司），以安徽宣城市水栀子种植基地的24批样本为代表性样品，采用峰面积的夹角余弦法确定特征峰，均数法计算特征值，筛选了24个共有峰，构成了水栀子UPLC指纹图谱共有模式（见图1）.

各取1批水栀子和栀子供试液，按“2.3”项下质谱条件用UPLC-Q-TOF MS进样测定，采用负离子扫描模式，对样本进行分析，得到其总离子流图，如图2所示.在指纹图谱研究工作基础上通过与标准品比对保留时间，化合物2、化合物3、化合物6、化合物7、化合物9、化合物15和化合物18分别鉴定为京尼平苷酸、山栀子苷B、绿原酸、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ.在暨南大学药学院周光雄教授课题组前期化学成分研究工作基础上［14-15］，通过与二级质谱高分辨分子量和质谱裂解信息，化合物4、化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、化合物19和化合物23分别鉴定为Jasminoside B、rehmapicrogenin、6″-O-反-香豆酰基京尼平龙胆二糖苷、3，5-O-二咖啡酰基-4-O-（3-羟基-3-甲基-戊二酰基）奎宁酸、6″-O-阿魏酰基京尼平龙胆二糖苷、6"-O-反式-肉桂酰京尼平龙胆二糖苷和西红花苷III.

水栀子药材UPLC指纹图谱总共有24个共有色谱峰，经UPLC-MS方法鉴定了其中14个色谱峰的化合物结构，其余10个化合物暂不能鉴定具体的结构.水栀子样本特征峰信息及部分化合物解析结果见表2.

2.8 相似度评价

以安徽宣城市水栀子种植基地24批样本建立的共有模式，计算不同产地水栀子药材及栀子药材的相似度，相似度计算结果见表1.结果安徽宣城市水栀子种植基地的24批样本相似度均在0.95以上，表明安徽宣城市水栀子种植基地不同种植片区和不同年份的24批样品所含的主要成分组分和比例均较为一致，样品各批次间质量较为均一；江西、广西和河南等不同产地水栀子药材的相似度也基本在0.90以上，表明不同省份种植的水栀子药材所含的主要指标性成分无明显差异；21批栀子样本的相似度，17批在0.90以上，其余4批相似度在0.80～0.90之间，表明栀子药材与水栀子药材所含的主要成分组分和比例也较为相似，不同产地的栀子药材之间相似度有一定差异.

2.9 PCA主成分分析

為了更好地分析不同产地水栀子药材及水栀子与栀子药材所含主要成分的差异，选择48批水栀子和21批栀子药材样本进行PCA分析.用主成分分析软件（Chennind ChemPattern 2020专业版，北京科迈恩科技有限公司），将69批样本图谱的数据进行标准化后，以峰面积作为特征自变量，进行主成分分析，结果第一和第三主成分累积方差为93.86%，具有统计学意义（P<0.05）.

主成分分析结果（见图3）表明，48批不同产地（24批安徽、7批江西、7批湖南、7批广西和3批其他产地）的水栀子样本均聚为一类，而21批栀子样本聚为另外一类.第三主成分得分最高为7号色谱峰（京尼平龙胆双糖苷），呈正相关；其次为3号色谱峰（山栀子苷B），呈负相关.表明所有栀子药材在其组成比例上与不同产地水栀子药材存在明显差异，21批栀子药材所含京尼平龙胆双糖苷含量明显高于水栀子药材，同时，栀子所含的山栀子苷B含量明显低于水栀子药材.其他色谱峰如15号和18号等，两者的面积也存在较大差异，但色谱峰的组成比例较为一致，故PCA分析得分较低.PCA主成分分析体现出了水栀子与栀子药材在化学成分组成比例方面的差异，可用于栀子与水栀子药材的鉴别.水栀子和栀子药材代表性样品色谱图如图4与图5所示，水栀子和栀子药材代表性样品24个共有峰的峰面积对比柱状图如图6所示.

3 结 论

通过对水栀子和栀子药材样品UPLC指纹图谱的相似度进行比较，可以看出，不同产区、不同基原的水栀子与栀子药材的相似度较为一致，表明水栀子与栀子药材所含主要指标性成分组成和比例较为一致.进一步对水栀子和栀子药材样品的UPLC指纹图谱进行PCA主成分分析，可以看出，水栀子和栀子药材各自聚为一大类.数据研究表明，水栀子与栀子药材所含特定指标性成分京尼平龙胆双糖苷和山栀子苷B比例有明显差异，可以用于水栀子与栀子药材的鉴别，并为今后水栀子药材的研究提供测定方法和数据支持.

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［15］覃芳敏.水栀子化学成分研究 ［D］.广州：暨南大学，2014.

（责任编辑：伍利华）

Abstract：

This paper aims to establish UPLC-Q-TOF MS chromatographic fingerprints of fructus Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai，and to analyze the fingerprints differences between Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.and Gardenia jasminoides Ellis.The sample was extracted by ultrasonic with 80% methanol，and the fingerprint was determined by ultra performance liquid chromatography.Some chromatographic peaks were qualitatively identified by MS，retention index and related literature;meanwhile，the main target components differences between Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.and Gardenia jasminoides Ellis were analyzed by similarity evaluation system and principal component analysis.The results show that there are 24 common components in the fingerprint of Gardenia  jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.and 14 of them are identified.The similarity is relatively consistent，but the sources of fructus Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.and Gardenia jasminoides Ellis.can be distinguished accurately by principal component analysis.The established fingerprint method can be used for the identification of the source of Gardenia  jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.and Gardenia jasminoides Ellis.The research results can provide experimental evidence for the identification of the authenticity of Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.and Gardenia jasminoides Ellis.

Key words：

Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.;Grdenia jasminoides Ellis;fingerprint;liquid chromatography;similarity;principal component analysis