纤维素酶酶解改性玉米粉工艺研究

张萌 张雨彤 王雪松 王岩

摘要：为探索酶法改性玉米粉技术，得到纤维素酶水解玉米粉的最佳酶解条件，以新鲜玉米粉为原料，研究酶浓度、酶解温度、酶解pH、酶解时间对还原糖含量的影响。通过单因素实验和响应面实验使最适酶解条件更优质，并通过扫描电镜比较微观结构的变化。经研究，纤维素酶酶解玉米粉最适酶解条件为酶解pH 5.31，酶解温度52.04 ℃，酶解时间4.28 h，纤维素酶浓度0.77％，此条件下还原糖含量为93.605 mg/mL。扫描电镜结果表明，纤维素酶酶解玉米粉，使玉米蛋白质和淀粉结合松散，结构更易于被破坏。该结果可为玉米粉的进一步改性提供基础原料，并对酶法改性玉米粉技术提供理论基础。

关键词：玉米粉；纤维素酶；响应面法；改性；还原糖

中图分类号：TS213.4      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）04-0120-07

Abstract： In order to explore the technology of enzymatic hydrolysis modification of corn flour and obtain the optimum enzymatic hydrolysis conditions of corn flour hydrolyzed by cellulase， with fresh corn flour as the raw material， the effects of enzyme concentration， enzymatic hydrolysis temperature， enzymatic hydrolysis pH and enzymatic hydrolysis time on the content of reducing sugar are studied.The optimum enzymatic hydrolysis conditions are made better by single factor experiment and response surface experiment， and the changes of microstructure are compared by scanning electron microscope.The results show that the optimal conditions for enzymatic hydrolysis of corn flour by cellulase are pH 5.31， enzymatic hydrolysis temperature 52.04 ℃， enzymatic hydrolysis time 4.28 h and cellulase concentration 0.77%. The reducing sugar content under these conditions is 93.605 mg/mL. Scanning electron microscope results show that the enzymatic hydrolysis of corn flour by cellulase makes the combination of corn protein and starch loose and the structure more easily to destroy. This result can provide basic raw materials for the further modification of corn flour and theoretical basis for the technology of enzymatic hydrolysis modification of corn flour.

Key words： corn flour; cellulase; response surface method; modification; reducing sugar

我國玉米的生产量和消费量均居世界前列[1-2]。在我国粮食产业经济发展中，玉米精深加工业占有重要地位，深加工产品主要集中在玉米淀粉、燃料、动物饲料等方面[3-5]。玉米精深加工业快速发展的同时，也存在产业链延伸不足、深加工价值高、功能性关键技术缺乏等制约优质发展的瓶颈[6]。

鉴于玉米直接作为食品仅占其产量的5%这一客观问题，从玉米粉微观结构着手，通过玉米粉改性技术使玉米在食品中的应用范围扩大，并进行玉米主食工业化开发，是对玉米深加工产业有利的补充和延展[7-9]。 在主食化开发过程中，由于玉米粉中的蛋白质、淀粉、营养组成和内部结构特性，使玉米粉的食用品质不尽如人意。为了提高玉米粉的加工和食用品质，Graham等 [10]利用物理法、化学法和生物法等手段进行了不同方式的研究，其中生物法对玉米粉改性是目前报道的效果最好且最常用的方法[11-12]。

李姝睿等[13]选择枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）胞外酶对玉米淀粉进行改性研究，经过研究得出，一方面，经酶改性后淀粉颗粒表面有明显的酶作用孔隙，但淀粉颗粒的晶型没有改变。另一方面，酶的作用会对玉米粉中的淀粉、蛋白质等主要成分产生影响，但这些变化会导致玉米粉的食用品质和加工品质发生变化，其产品还需要进一步研究。

纤维素作为植物细胞壁的主要成分，占玉米粉总质量的10%左右。其化学性质不活泼，结构单元的分子间力极强，由于分子内氢键的存在，使本就相连的糖苷键无法旋转，进而使纤维素的刚性显著增强[14-15]。纤维素的存在会直接影响玉米粉的改性加工过程，阻碍酶与淀粉和蛋白质在空间上的接触几率，从而影响主食产品制作过程和产品品质[16-18]。

本实验针对纤维素酶存在影响玉米粉改性过程、影响消化吸收的问题，选择纤维素酶，部分降解玉米粉中纤维素，通过单因素实验，以还原糖量的变化为指标，研究各因素对玉米粉还原糖含量的影响，然后通过设计响应面实验对纤维素酶酶解玉米粉的最佳工艺条件进行确定，研究结果为进一步优化酶法改性玉米粉的微观结构提供了参考，为玉米粉进一步加工利用提供了原料。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

精制玉米粉：齐齐哈尔市恒昌玉米种植专业合作社；纤维素酶：南宁东恒华道生物科技有限责任公司；食用碱：市售。

盐酸：天津市富宇精细化工有限公司；氢氧化钠：天津市天力化学试剂有限公司；3，5-二硝基水杨酸：国药集团化学试剂有限公司；无水亚硫酸钠、酒石酸钾钠、苯酚：天津市凯通化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

722S可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司； CT-C-IA热风循环烘箱 常州市佳腾干燥制粒设备有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 常州市荣华仪器制造有限公司；FE28 pH计 梅特勒托利多公司；台式微量高速离心机 华日机械有限公司；搅拌机 日本日立株式会社。

1.3 实验方法

1.3.1 酶改性玉米粉的方法

将100 g玉米粉与300 mL蒸馏水混合均匀，放入一定温度的水浴锅里，用搅拌器进行搅拌，待搅拌平稳后，调到一定pH 值，加入酶，每隔30 min调到一定的pH取样，离心，取1 mL上清液，加入3 mL DNS（3，5-二硝基水杨酸溶液），100 ℃水浴15 min，在550 nm处测定吸光值[19-20]。

1.3.2 单因素实验

在纤维素酶酶解玉米粉的工艺条件下，固定酶解pH为7，酶解温度为50 ℃，酶解时间为2.5 h，酶浓度为0.1%（质量比），研究各因素对还原糖含量的影响。

1.3.2.1 酶解时间对还原糖含量的影响

以酶解pH为7，酶解温度为50 ℃，酶浓度为0.1%（质量比），研究酶解时间（1～4 h）对还原糖含量的影响。

1.3.2.2 酶解温度对产生还原糖含量的影响

以酶解pH为7，酶浓度为0.1%（质量比），酶解时间为2.5 h，研究酶解温度（30～70 ℃）对还原糖含量的影响。

1.3.2.3 酶解pH对还原糖含量的影响

以酶解温度为50 ℃，酶浓度为0.1%（质量比），酶解时间为2.5 h，研究酶解pH（3～7）对还原糖含量的影响。

1.3.2.4 酶浓度对还原糖含量的影响

以酶解pH为7，酶解温度为50 ℃，酶解时间为2.5 h，研究酶浓度0.1%～1.0% （质量比）对还原糖含量的影响。

1.3.3 响应面实验

在采用单因素实验的同时，运用Design Expert 8.0.6软件，基于 Box-Behnken设计原理，以A（酶解时间）、B（酶浓度）、C（酶解温度）、D（酶解pH）为自变量，以还原糖含量为响应值，设计了四因素三水平的响应面优化实验，具体的实验因素和水平设计见表1。

1.4 酶改性玉米粉微观形貌观察

用导电胶带将适量的待测玉米粉粘贴在样品台后，置于扫描电子显微镜的载物台上，并不断放大至500，1 500，2 000，3 000倍，对样品的微观结构进行观察。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 酶解时间对玉米粉还原糖含量的影响

由图1可知，随着酶解时间的增加，还原糖含量呈上升趋势。当酶解时间为0～2 h时，还原糖含量稳定增加，2～2.5 h增加较快，但4 h时还原糖含量与2.5 h时还原糖含量相差不大，可能是由于底物浓度是一定的，所以在2.5 h时底物已经基本水解完全，从实际生产中的经济效益方面考虑，选定酶解时间为2.5 h进行下一步实验[21]。

2.1.2 酶浓度对玉米粉还原糖含量的影响

由图2可知，随着纤维素酶浓度的增加，还原糖含量也逐渐增加，当纤维素酶的添加浓度为0.1%～0.75%时，还原糖含量缓慢增加，从0.75%开始急速增加，酶浓度达到1.0％时，还原糖含量最高。一方面可能是由于酶的浓度越高，可以酶解出更多的还原糖；另一方面可能是由于水解时间过长，淀粉糊化导致总糖含量升高。当纤维素酶浓度为0.1%时，还原糖含量相对较高。根据在实际生产中节约成本的原则，选择0.1%的酶浓度进行下一步实验[22]。

2.1.3 酶解溫度对玉米粉还原糖含量的影响

酶的催化效率会受温度变化的影响。由图3可知，随着温度的升高，还原糖含量呈先升后降的趋势。还原糖含量最高时的温度为60 ℃。这是因为纤维素酶的活性会随着温度的降低而受到抑制，温度升高到一定程度会导致酶失活，所以得到还原糖量很少，表明温度对酶具有双重作用[23]。所以，选择酶解温度为50 ℃进行下一步实验。

2.1.4 酶解pH对玉米粉还原糖含量的影响

pH会影响纤维素酶的活性，pH过酸或者过碱都可能导致纤维素酶的活性降低。

由图4可知，随着pH的增加，还原糖含量出现先升高后降低的趋势，达到最大值时的pH值为6。本次实验所确定的最佳pH为6[24]。

2.2 响应面优化设计及结果分析

2.2.1  响应面设计实验与结果

以A（酶解时间）、B（酶浓度）、C（酶解温度）、D（酶解pH）为自变量，以产生的还原糖含量为响应值，设计了四因素三水平的响应面优化实验共29组。具体实验设计及结果见表2[25-26]。

2.2.2 回归模型的建立及显著性分析

运用Design Expert 8.0.6软件对响应面检验结果进行回归拟合，得到以A（酶解时间）、B（酶浓度）、C（酶解温度）、D（酶解pH）为自变量，以产生的还原糖含量Y为响应值的二次多项回归方程：

Y=-435.031 04+32.383 62A+130.737 89B+74.954 93C+8.032 61×11.539 33AB-0.395 64AC-0.126 88AD-4.476 22BC-0.196 89BD-1.624 00E-0.03×CD-3.830 05A2-94.557 61B2-6.494 95C2-0.070 464D2。

回归模型的方差分析见表3。

由表3可知，该模型的F值为15.65，P值＜0.000 1，表示该模型差异极显著；失拟项的P值=0.156 9>0.05，不显著，表示回归模型可以接受；模型中B、A2、B2、C2，D2对还原糖含量的影响极显著，A、D、AB对还原糖含量的影响显著，C、AC、AD、BC、BD、CD对还原糖含量的影响不显著。根据F值和P值，各因素对还原糖含量的影响大小为酶浓度＞酶解pH＞酶解时间＞酶解温度。模型决定系数R2=0.939 9，该模型可用于分析和预测由纤维素酶酶解玉米粉产生的还原糖。

2.2.3 响应面分析

由图5可知，时间不变，还原糖含量随着酶浓度的增加呈先升后降的趋势；当酶浓度恒定时，时间在1～6 h范围内变化，随着时间的延长，还原糖含量逐渐增加，当时间达到一定值时，还原糖含量趋于平缓且有下降趋势。

由图6可知，时间不变，随着pH值的逐步增加，还原糖含量逐步增加，当pH值达到一定值时，还原糖含量开始下降，这是由于pH会影响纤维素酶的活性，纤维素酶在中性或是偏碱性的溶液中有更好的溶解性，pH过酸或者过碱都可能导致纤维素酶的活性降低；当pH值不变时，时间在1～6 h范围内变化，随着时间的延长，还原糖含量随之增加，而当时间达到一定值时，还原糖含量呈现明显下降趋势。

由图7可知，时间不变，随着温度的升高，还原糖含量呈现先升高后下降的趋势，这是由于温度过低会抑制纤维素酶活性，温度过高会导致酶失活。当温度不变时，延长时间，还原糖含量升高，当达到一定时间时，还原糖含量趋于缓慢增加，并有下降趋势。

由图8可知，酶浓度一定时，随着pH值的逐渐增加，还原糖含量逐渐增加，当pH值达到一定值时，还原糖含量开始下降；当pH值不变时，酶浓度在0.1%～1.0%范围内变化，升高纤维素酶浓度的同时，还原糖含量也逐渐增加。可能是由于酶的浓度越高，可以酶解出更多的还原糖，还可能是由于水解时间过长，淀粉糊化导致总糖含量升高。

由图9可知，当温度恒定时，随着酶浓度的逐渐增加，还原糖含量逐渐增加，当酶浓度恒定时，温度在30～80 ℃范围内变化，还原糖含量随温度的升高而明显增加，当温度达到一定值时，还原糖含量下降趋势十分明显。

由图10可知，温度一定时，随着pH值的逐步增加，还原糖含量逐步增加，当pH值达到一定值时，还原糖含量呈下降趋势；当pH值不变，温度在30～80 ℃范围内变化，随着温度的升高，还原糖含量也逐渐增加，温度达到一定值时，还原糖含量呈下降趋势。

由图5～图10可知，酶浓度与酶解时间的交互作用对还原糖含量的影响较大，其中对还原糖含量影响最大的是酶浓度，曲线较陡，其次是酶解pH、酶解时间和酶解温度，这与方差分析的结果一致。

2.2.4 最佳工藝验证实验

根据响应面优化测试产生最佳条件：酶解pH 5.31，酶解温度52.04 ℃，酶解时间4.28 h。纤维素酶的浓度为0.77％，做一组验证实验，将实验结果与优化实验预测的最佳还原糖含量对比。以上述最佳条件实际测得还原糖含量为93.605 mg/mL，模型预测值为94.289 mg/mL，误差为0.7%，实验结果准确，说明该模型能够较好地预测还原糖含量。

2.3 酶改性对玉米粉微观形态的影响

由图11和图12可知，玉米中的纤维素会减弱外界条件对内部结构的影响，在纤维素酶处理后淀粉和蛋白质的结合体明显出现松散和形态变化。原玉米粉粒径较大，大小差异显著，质地紧密，无明显裂纹和沟壑，较小颗粒存在少量微小孔洞，这是由于玉米粉中蛋白质和淀粉的紧密结合造成的，经纤维素酶处理之后，玉米粉表面出现明显的沟壑和裂纹，可能是由于在纤维素处理后，改变了玉米粉中蛋白质和淀粉的结合方式，促进了淀粉的溶胀。仍呈现不规则的立体结构，较大粒径玉米粉数量下降，大颗粒玉米粉坍塌成小颗粒，且较小颗粒表面孔洞数量明显高于原玉米粉。

3 讨论

玉米曾经一度是我国民众重要的食物来源，然而伴随着国民经济的持续发展，人们对待食品方面的要求更加严格，玉米的加工水平以及食用效果差等让玉米食品渐渐离开人们的主食桌。现阶段，依托科技含量更高的现代加工手段来达到改善口感、增强品质的效果是实现玉米深加工研究工作的重难点。

现阶段玉米粉的生物改性主要是依靠微生物发酵或者是生物酶水解的方式对玉米粉内的分子结构实现修饰处理，进而使得玉米粉的黏性以及保水力等特性得以优化。王景会等采用生物酶对玉米粉进行修饰改性，发现改性可减少玉米粉中的总淀粉和蛋白含量，增加溶解度和直链淀粉含量，从而改善玉米面团的品质。田益玲等研究表明，当葡萄糖氧化酶浓度为80 mg/kg时，25 ℃浸泡6 h可以使玉米粉的品质得到提高。王富盛等采用复合酶对玉米粉进行改性后发现，单一酶对玉米粉的改性程度有限，多酶复合改性可以改善玉米粉的黏弹性和延展性。

虽然和多种酶复合水解玉米粉的结果相比会有差距，但在玉米粉加工过程中，经常会忽视纤维素对玉米粉加工利用的影响，所以本实验以还原糖含量为指标，通过单因素实验和响应面实验优化纤维素酶水解玉米粉关键工艺条件，最终确定其酶解工艺条件。

4 结论

利用响应面法对纤维素酶酶解玉米粉的工艺条件进行优化，响应面实验确定的最佳条件：酶解pH为5.31，酶解温度为52.04 ℃，酶解时间为4.28 h，纤维素酶浓度为0.77％。验证实验得到的还原糖含量为93.605 mg/mL，模型预测值为94.289 mg/mL，相对误差为0.7%，酶解效果较好。通过纤维素酶对玉米粉进行改性，改善玉米粉的结构，从而使玉米粉微观结构发生变化，使玉米粉中的淀粉和蛋白质等成分充分暴露，更易受到外界条件的影响，为复合酶改性玉米粉提供了原料，有利于玉米粉的应用。但未考虑到加热条件是否会对还原糖的含量造成一定的影响，以及淀粉糊化对玉米粉的结构会不会造成影响。由于玉米中纤维素含量较少，多数学者可能会忽视纤维素对玉米粉加工的影响。采用纤维素酶将玉米粉中的纤维素降解，为玉米粉加工提供了一定的数据参考。

参考文献：

[1]陈印军，王琦琪，向雁.我国玉米生产地位、优势与自给率分析[J].中国农业资源与区划，2019，40（1）：7-16.

[2]BAGHBANI-ARANI A， POUREISA M， ALEKAJBAF H， et al. Current status of genetically modified crops in Iran and the world： overview of production and consumption challenges[J].Research & Reviews in BioSciences，2021（11）：265062.

[3]谌琴，刘冬竹，曹智，等.引导玉米深加工行业健康发展促进行业转型升级[J].中国粮食经济，2020（10）：63-65.

[4]刘笑然，曹乐乐，付香敏.2018/2019年度我国玉米市场分析与展望[J].中国粮食经济，2019（2）：52-55.

[5]VACLAVIK V A， CHRISTIAN E W， CAMPBELL T. Starches in Food[M]//Essentials of Food Science.Heidellberg：Springer，2021：39-53.

[6]刘景圣，闵伟红，王玉华，等.玉米精深加工关键技术创新与应用[J].中国畜牧业，2020（4）：32.

[7]RANUM P， PENA-ROSAS J P， NIEVES GARCIA-CASAL M. Global maize production， utilization， and consumption[J].Annals of the  New York Academy of Sciences，2014，4（1312）：105-112.

[8]HOLMES M， RENK J S， COALDRAKE P， et al. Food-grade maize composition， evaluation， and genetics for masa-based products[J].Crop Science，2019，59（4）：1392-1405.

[9]AKHARUME F U， ALUKO R E， ADEDEJI A A， et al.Modification of plant proteins for improved functionality：a review[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2021，20（1）：198-224.

[10]GRAHAM R D， WELCH R M， BOUIS H E. Addressing micronutrient malnutrition through enhancing the nutritional quality of staple foods： principles， perspectives and knowledge gaps[J].Advances in Agronomy，2001（70）：77-142.

[11]NUSS E T， TANUMIHARDJO S A. Maize： a paramount staple crop in the context of global nutrition[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2010，9（4）：417-436.

[12]HAGER A S， WOLTER A， JACOB F， et al. Nutritional properties and ultra-structure of commercial gluten free flours from different botanical sources compared to wheat flours[J].Journal of Cereal Science，2012，56（2）：239-247.

[13]李姝睿，牛春华，刘新凤，等.枯草芽孢杆菌胞外酶对于玉米粉的修饰改性研究[J].中国酿造，2013，32（9）：60-63.

[14]李昭锋，曹潇，朱杰，等.細菌纤维素在植物细胞壁结构与功能研究中的应用及进展[J].食品科学，2020，41（19）：263-271.

[15]苏思婷.微晶纤维素超分子结构与蛋白质的相互作用及机理研究[D].广州：华南理工大学，2014.

[16]MURALIKRISHNA G， RAO M V S S T S. Cereal non-cellulosic polysaccharides：structure and function relationship-an overview[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2007，47（6）：599-610.

[17]ROMAN L， BELORIO M， GOMEZ M. Gluten-free breads： the gap between research and commercial reality[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2019，18（3）：690-702.

[18]MCKEE L H， LATNER T A. Underutilized sources of dietary fiber： a review[J].Plant Foods for Human Nutrition，2000，55（4）：285-304.

[19]彭丹丹.复合酶液化高浓度玉米淀粉乳的研究[D].无锡：江南大学，2015.

[20]ZHANG H， WANG H， CAO X， et al. Preparation and modification of high dietary fiber flour：a review[J].Food Research International，2018，113：24-35.

[21]王富盛，刘景圣.多酶复合对玉米粉质构特性的影响[J].中国食物与营养，2012，18（3）：49-53.

[22]余飞.酶技术在酶解玉米粉制备过程中的工艺研究[J].中国食品添加剂，2016（6）：156-160.

[23]刘磊，邱婷婷，赵志浩，等.预酶解-挤压膨化工艺改善玉米全粉冲调分散性[J].现代食品科技，2018，34（10）：141-146，170.

[24]LIU J， YUAN T， WANG R， et al. The properties and tortilla making of corn flour from enzymatic wet-milling[J].Molecules，2019，24（11）：2137-2153.

[25]LUCILLA S， GABRIELE G， UMBERTO V， et al. Immunoreactivity of gluten-sensitized sera toward wheat， rice， corn， and amaranth flour proteins treated with microbial transglutaminase[J].Frontiers in Microbiology，2019，10：470.

[26]姚人勇，劉英.响应面分析法优化糙米纤维酶解工艺[J].食品科技，2009，34（11）：147-151.