响应面法优化酱渣中大豆异黄酮超声辅助乙醇提取工艺

唐银 朱梓瑞 许树荣 何贵萍 李硕 吕远平

摘要：以酱渣为原料，利用响应面法优化酱渣中大豆异黄酮的超声辅助乙醇提取工艺。在单因素试验的基础上，探究乙醇浓度、提取温度、提取时间、超声功率对大豆异黄酮提取率的影响，并利用Box-Behnken響应面法优化提取工艺。结果表明，在乙醇浓度54.6%、提取温度49.7 ℃、提取时间127.9 min、超声功率436.7 W条件下提取率最高，为0.711%。简化条件进行验证试验，得到大豆异黄酮的提取率为0.708%，与理论值基本吻合，模型可靠。该研究为酱渣的综合利用及大豆异黄酮的提取提供了理论参考。

关键词：酱渣；大豆异黄酮；响应面法；超声提取

中图分类号：TS201.2      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）04-0115-05

Abstract： With sauce residue as the raw material， response surface methodology is used to optimize the ultrasonic-assisted ethanol extraction process of soy isoflavones from sauce residue. Based on the single factor test， the effects of ethanol concentration， extraction temperature， extraction time and ultrasonic power on the extraction rate of soy isoflavones are studied. The Box-Behnken response surface method is used to optimize the extraction process. The results show that the extraction rate is the highest of 0.711% when the ethanol concentration is 54.6%， the extraction temperature is 49.7 ℃， the extraction time is 127.9 min， and the ultrasonic power is 436.7 W. Simplifying the conditions for verification test， and the results show that the extraction rate of soy isoflavones is 0.708%， which is close to the theoretical value， indicating that the model is reliable. The study has provided theoretical references for the comprehensive utilization of sauce residue and the extraction of soy isoflavones.

Key words： sauce residue; soy isoflavones; response surface methodology; ultrasonic extraction

大豆异黄酮是一类主要存在于大豆及其豆制品中的次级代谢产物，具有较高的营养价值和药用价值[1—2]。大豆异黄酮因具有明显的抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等作用[3—4]，被广泛应用于医疗和食品等行业[5]。

酱渣是酱油酿造的副产物，每生产1吨酱油将产生0.67 吨酱渣[6]。酱渣水分含量较高，在空气中极易腐败变质，若不妥善处理将造成严重的环境污染。酱渣中含有丰富的蛋白质、油脂、粗纤维及大豆异黄酮等[7]，具有较高的利用价值；而酱渣中较高的盐含量制约了其深加工利用的发展[8]。目前将酱渣用于制备动物饲料和肥料的工艺附加值低，且存在适口性差或易导致土壤盐化等问题[9-10]。因此，进行大豆异黄酮的提取是酱渣高值化利用的一个重要方向[11]。

大豆异黄酮的提取方法主要有微波提取法、溶剂萃取提取法、超声波提取法、超临界流体萃取提取法等[12]。微波提取法和超临界流体萃取提取法具有不利于纯化或提取成本过高的缺点[13—14]。传统溶剂提取法虽然提取成本比较低，但提取率不高。超声波提取法是利用超声波产生强烈的搅拌等作用，使原料中的大豆异黄酮进入溶剂中，能够提高大豆异黄酮的提取率[15]。因此，本文将结合超声波与溶剂萃取提取技术提取大豆异黄酮，并应用响应面优化提取条件，以寻找一种成本低廉、提取率高且具有较高经济效益的提取方法，为酱渣的综合利用及大豆异黄酮的提取提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱渣：四川合江县永兴诚酿造有限责任公司；染料木素标准品（纯度≥98%）：上海同田生物技术有限公司；石油醚、无水乙醇等：均为国产分析纯，成都市科隆化学品有限公司。

1.2 主要仪器与设备

UV-6000PC紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；H1850高速台式离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；RE-52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；KQ5200DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；SMF01磨粉机 浙江绍兴苏泊尔用品有限公司；SQP电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酱渣的预处理

将新鲜酱渣置于60 ℃烘箱中干燥，烘干后用粉碎机粉碎得到干酱渣样品；取适量干酱渣，按照料液比1∶10用石油醚浸泡24 h，过滤除去石油醚并烘干得到脱脂酱渣。

1.3.2 大豆异黄酮的提取

准确称取脱脂酱渣1 g于100 mL具塞锥形瓶中，以料液比1∶50加入60%乙醇溶液并搅拌均匀，设置温度50 ℃、超声功率420 W，在此条件下提取120 min，提取结束后将提取液转移至离心管中，于6 000 r/min条件下离心20 min，离心所得上清液即为大豆异黄酮粗提液。

1.3.3 标准曲线的制作

准确称取5 mg染料木素标准品于50 mL容量瓶中，以95%乙醇溶液定容，再以95%乙醇溶液为空白对照，在259 nm处测定吸光度。分别以染料木素含量（μg/mL）和吸光度为横、纵坐标，绘制标准曲线，见图1。染料木素标准溶液的浓度与吸光度具有较好的线性关系，回归方程为y=0.118 2x+0.116 3，R2=0.999 5。

1.3.4 样品检测及提取率计算

取200 μL“1.3.2”中所得的粗提液于10 mL容量瓶中，以95%乙醇溶液定容，再以95%乙醇溶液为空白对照，在259 nm处测定吸光度，并按下式计算酱渣中大豆异黄酮的提取率。

w=c×n×Vm×1 000×100%。

式中：w为酱渣中大豆异黄酮提取率，%；c为测试液中大豆异黄酮浓度，μg/mL；n为稀释倍数；V为提取液的体积，mL；m为样品质量，g。

1.3.5 单因素试验设计

按“1.3.2”中方法对酱渣中大豆异黄酮进行提取。选择乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间、超声功率5个因素，考察各个因素对酱渣中大豆异黄酮提取率的影响。

1.3.5.1 乙醇浓度对大豆异黄酮提取率的影响

在料液比为1∶50的条件下，设置提取温度50 ℃、超声功率300 W、提取时间60 min，分别选择乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%、90%进行试验，并计算提取率。

1.3.5.2 料液比对大豆异黄酮提取率的影响

在乙醇浓度为60%的条件下，设置提取温度50 ℃、提取时间60 min、超声功率300 W，分别选择料液比为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70进行试验，并计算提取率。

1.3.5.3 提取温度对大豆异黄酮提取率的影响

在乙醇浓度为60%的条件下，设置料液比1∶50、提取时间60 min、超声功率300 W，分别选择提取温度为40，45，50，55，60 ℃进行试验，并计算提取率。

1.3.5.4 提取时间对大豆异黄酮提取率的影响

在乙醇浓度为60%的条件下，设置料液比1∶50、提取温度50 ℃、超声功率300 W，分别选择提取时间为30，60，90，120，150，180 min进行试验，并计算提取率。

1.3.5.5 超声功率對大豆异黄酮提取率的影响

固定乙醇浓度60%、料液比1∶50、提取温度50 ℃、提取时间60 min，分别选择超声功率为240，300，360，420，480，540，600 W进行试验，并计算提取率。

1.3.6 响应面试验设计

根据单因素试验结果，选择乙醇浓度、提取温度、提取时间、超声功率4个因素，利用Design Expert 10软件进行响应面试验设计，设计方法见表1。

2 结果与讨论

2.1 大豆异黄酮提取的单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度的影响

由图2可知，当乙醇浓度较低时，大豆异黄酮的提取率随着乙醇浓度的增大而增大；而当乙醇浓度超过60%后，大豆异黄酮的提取率降低。根据相似相溶原理，乙醇浓度的增大使溶液的极性与大豆异黄酮的极性逐渐接近，大豆异黄酮更容易溶出，提取率增大；而当乙醇浓度过高时，溶液中蛋白质、糖类等大分子聚集，使物料质构紧密，阻碍了大豆异黄酮的溶出[16]，故合适的乙醇浓度为60%左右。

2.1.2 料液比的影响

由图3可知，大豆异黄酮的提取率随着液料比的增大而增大，但在料液比达到1∶50后，大豆异黄酮的提取率增大不明显。当料液比较小时，高浓度的溶液影响了大豆异黄酮分子溶出，导致提取率较低；随着料液比的增大，溶液浓度降低，大豆异黄酮分子扩散速度加快，提取率增大；当料液比达到1∶50时，大豆异黄酮的提取接近饱和，因此提取率不再随料液比的增大而增大[17]。考虑到提取成本以及操作难度，固定料液比为1∶50。

2.1.3 提取温度的影响

由图4可知，大豆异黄酮的提取率随着提取温度的升高先增大后减小，并在温度为50 ℃时最高。温度的提高加快了分子运动，使异黄酮加快溶出，提取率增大；但过高的温度会导致酱渣中蛋白质等变性凝固，物料质构变得质密坚实，阻碍了大豆异黄酮溶出，使提取率下降[18]。因此，控制提取温度为50 ℃左右。

2.1.4 提取时间的影响

由图5可知，随着提取时间的增加，大豆异黄酮的提取率总体呈上升趋势；但当提取时间大于120 min时，大豆异黄酮的提取率开始下降。可能是因为随着提取的进行，大豆异黄酮逐渐进入溶液中，提取率逐渐提升；但当提取时间太长时，大豆异黄酮可能发生了降解，导致提取率降低[19]。本试验合适的提取时间为120 min左右。

2.1.5 超声功率的影响

由图6可知，当超声功率小于420 W时，大豆异黄酮的提取率随着超声功率的增大而提升；当超声功率大于420 W时，大豆异黄酮的提取率明显减小。可能是因为随着超声功率的增大，超声波产生的机械作用增强，使酱渣中大豆异黄酮分子振动加快，大豆异黄酮分子更易溶出；当超声功率过大时，超声空化作用所产生的空化泡半径变小，空化泡爆裂所产生的能量减小，大豆异黄酮分子的振动减弱，导致其溶出效率降低，使提取率下降[20]。因此，适宜的超声功率为420 W左右。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果

以A（乙醇浓度）、B（提取温度）、C（提取时间）、D（超声功率）为变量，以酱渣中大豆异黄酮的提取率为响应值，根据Design Expert 10软件提供设计的组合进行试验，结果见表2。

2.2.2 响应面模型分析

响应面模型方差分析结果见表3。

对表2中试验数据进行回归分析，得出酱渣中大豆异黄酮提取率的回归方程，提取率=0.69-0.039A+0.028B+0.016C+0.020D+3.25×10-3AB+6.25×10-3AC+0.013AD-0.011BC-0.016BD-0.018CD-0.035A2-0.045B2-0.024C2-0.017D2。

由表3可知，本试验模型的P<0.01，回归模型极显著，失拟项的P=0.485 6，表明该模型可用于分析和预测超声辅助乙醇提取酱渣中大豆异黄酮的提取率。

模型中乙醇浓度、提取温度、提取时间及超声功率的P值均小于0.01，表明这4个因素对酱渣中大豆异黄酮提取率的影响都显著。各因素的F值分别为280.60，149.30，46.96，75.72，可知各因素对酱渣中大豆异黄酮提取率的影响程度由高到低为A（乙醇浓度）>B（提取温度）>D（超声功率）>C（提取时间）。

2.2.3 响应面交互作用分析

由软件根据回归方程得到响应面与等高线，通过等高线的形状可以看出两因素交互对大豆异黄酮提取率的影响强弱，等高线为圆形则影响弱，等高线为椭圆则影响强。

乙醇浓度与提取温度、乙醇浓度与提取时间的两两交互作用不强，对大豆异黄酮提取率的影响不显著（P>0.05），响应面图与等高线图不做展示；提取温度与提取时间两两交互作用强，对大豆异黄酮提取率的影响显著（P<0.05），乙醇浓度与超声功率、提取温度与超声功率、提取时间与超声功率两两交互作用极强，对大豆异黄酮提取率的影响极显著（P<0.01），见图7～图10。

2.2.4 最佳工艺确定及验证试验

通过软件分析，酱渣中大豆异黄酮提取的最优条件为乙醇浓度54.6%、提取温度49.7 ℃、提取时间127.9 min、超声功率436.7 W，在此条件下，大豆异黄酮的理论提取率为0.711%。考虑到试验条件，根据实际情况，选择乙醇浓度55%、提取温度50 ℃、提取时间130 min、超声功率420 W进行3次重复试验，得到大豆异黄酮提取率平均值为0.708%，与理论值接近，说明该模型预测与实际较为吻合，采用响应面法优化得到的大豆异黄酮提取工艺具有一定理论参考价值。

3 结论

本试验以大豆异黄酮提取率为指标，采用单因素试验与响应面试验优化酱渣中大豆异黄酮的提取工艺。结果表明，最佳提取条件为乙醇浓度54.6%、提取温度49.7 ℃、提取时间127.9 min、超声功率436.7 W，将此条件优化后进行验证试验得到大豆异黄酮的提取率为0.708%，与理论值0.711%接近。该研究结果可以为酱渣的综合利用提供理论参考，为大豆异黄酮的提取提供理论技术指导。

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