酱油球拟酵母的安全性研究

张梦丽 廉瑞 丁婷婷 赵悦 冯怡华 王春玲

摘要：对酱油发酵用菌球拟酵母的安全性进行了初步研究。通过抑菌圈、最低抑菌浓度实验与血平板实验研究菌种的耐药性和溶血性；利用气相色谱-质谱联用法与液相色谱-质谱联用法探讨了球拟酵母在酱油发酵过程中的挥发性与非挥发性代谢产物。结果表明，球拟酵母对抗生素中的酮康唑、伏立康唑敏感，对氟康唑、两性霉素B存在剂量依赖性，氟康唑对球拟酵母的MIC为4 μg/mL，两性霉素B对球拟酵母的MIC为1 μg/mL，表明球拟酵母对两性霉素B和氟康唑敏感，不具有耐药性；血平板实验结果表明球拟酵母不具备溶血性。添加球拟酵母的酱油在发酵终端的代谢产物分析中未检测到有害物质，且球拟酵母能利用原料中的糖类产生相应的酯类物质，并在添加球拟酵母的酱油中检测到了较多的特征风味化合物，如吡喃酮。

关键词：酱油；球拟酵母；代谢特征；安全性

中图分类号：TS264.21      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）04-0050-05

Abstract： A preliminary study is conducted on the safety of Torulopsis globosa used for soy sauce fermentation. The drug resistance and hemolysis of bacteria are studied by bacteriostatic zone， minimum inhibitory concentration experiment and blood plate experiment; the volatile and non-volatile metabolites of T. globosa in the fermentation process of soy sauce are investigated by gas chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography-mass spectrometry. The results show that T. globosa is sensitive to ketoconazole and voriconazole in antibiotics， and is dose-dependent on fluconazole and amphotericin B. The MIC of fluconazole to T. globosa is 4 μg/mL， and the MIC of amphotericin B to T. globosa is 1 μg/mL， indicating that T. globosa is sensitive to amphotericin B and fluconazole， and has no drug resistance. The results of blood plate experiment show that T. globosa has no hemolysis. No harmful substances are detected in the analysis of metabolites at the fermentation terminal of soy sauce added with T. globosa， and T. globosa can utilize sugar in the raw material to produce corresponding esters， and more characteristic flavor compounds such as pyrones are detected in soy sauce added with T. globosa.

Key words： soy sauce; Torulopsis globosa; metabolic characteristics; safety

酱油主要是以含蛋白质和淀粉质的原料为主要原料，经一系列微生物发酵制成的具有特殊色、香、味的调味品[1]，因其具有独特的风味和营养价值备受欢迎。通过添加酵母菌来改善酱油的香气成为近年来的研究热点[2-4]。酵母主要包括醇香型的鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和酯香型的球擬酵母（Torulopsis globosa）[5-6]，鲁氏酵母利用酱醪中的糖进行醇类的发酵，赋予酱油醇香，乙醇有一定的抑菌作用，有利于酱油的保存[7-9]。球拟酵母作为酱油酿造过程中的后熟酵母，可以利用发酵液中的醇类与酱油中的酸类物质形成酯类物质，参与酱醪成熟及香味物质的生成，使酱油的酯香味更浓郁[10-12]。

菌种的安全直接关系到食品的安全与公众健康，球拟酵母虽然是传统发酵菌株，但目前关于其安全性的研究鲜有报道，且国内外尚没有具体、完整的酱油菌种安全评价方法。本研究通过探讨球拟酵母的耐药性[13-14]、溶血性[15-16]来确定菌种自身的安全性以及从酵母参与的酱醪发酵后的代谢组学分析等方面入手，考察其安全性，从而为其应用安全性评价提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

球拟酵母（Torulopsis globosa）：天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室菌种保藏中心；豆粕、炒小麦：购于农贸市场；氟康唑、两性霉素B：上海源叶生物科技有限公司;药敏纸片系列（制霉菌素、两性霉素B）：上海桥星贸易有限公司；酮康唑、氟康唑、伏立康唑：上海欣中生物工程有限公司；YPD（酵母浸出粉胨葡萄糖，yeast extract peptone dextrose）液体培养基、YPD琼脂培养基、血琼脂平板培养基：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP 2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；Q Exactive Orbitrap LC-MS/MS质谱仪、Multiskan GO酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；LRH-250-A生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 耐药性实验

1.3.1.1 药敏纸片法

采用药敏纸片琼脂扩散法[17]。

向无菌的YPD固体培养基中加入100 μL浓度为1×105 CFU/mL的球拟酵母菌液，均匀涂布后用镊子分别放入氟康唑、伏立康唑、酮康唑、两性霉素B药片，放入30 ℃培养箱中倒置培养48 h，观察并测量抑菌圈直径。

1.3.1.2 最低抑菌浓度测定

根据CLSI M27-A3[18-19]中酵母菌稀释法进行药物敏感实验。

1.3.2 溶血性实验[20]

于无菌操作台上将血琼脂平板倒置，去除其中液体，随后分别使用接种环划线金黄色葡萄球菌、球拟酵母于血琼脂培养基上，金黄色葡萄球菌于37 ℃培養箱中倒置培养12 h，球拟酵母于30 ℃培养箱中倒置培养48 h，观察二者是否出现溶血现象。

1.3.3 酱油中球拟酵母代谢物测定

1.3.3.1 酱油发酵

制备种曲→大曲制作（豆粕与炒小麦）→蒸煮→接种制曲→成曲→加盐水发酵→接入球拟酵母（不添加球拟酵母组记作A组，添加球拟酵母组记为B组）→酱醪发酵→成品。

1.3.3.2 挥发性代谢物

采用固相微萃取GC-MS法测定酱油中的挥发性代谢物[21]。

1.3.3.3 非挥发性代谢物

采用LC-MS法测定酱油中的非挥发性代谢物[22-23]。

1.4 数据统计与分析

利用 SIMCA 14.1对数据进行分析；利用Origin 2018作图。

2 结果与分析

2.1 耐药性实验

2.1.1 药敏实验

将培养皿放入30 ℃培养箱中观察，培养48 h后得结果见图1。

图1中酮康唑和伏立康唑培养皿出现明显抑菌圈，酮康唑抑菌圈直径为4.6 cm，大于标准敏感值（2.8 cm），伏立康唑抑菌圈直径为3.4 cm，大于标准敏感值（1.7 cm）。根据M27药敏实验纸片法，判定球拟酵母对酮康唑和伏立康唑不具有抗药性。

2.1.2 确定最低抑菌浓度

对没有出现明显抑菌圈的氟康唑和两性霉素B进行进一步抗药性实验。依据CLSI M27-A3中酵母菌稀释法进行药物敏感实验，结果见图2。

判读时，与阳性对照相比，唑类药物的最低抑菌浓度（MIC）应抑制80%的真菌生长，两性霉素（多烯类）则要求达到100%生长抑制。由图2可知，氟康唑浓度在4 mg/L时，只有20%的球拟酵母能生长，球拟酵母的生长达到了80%抑制，因此氟康唑对球拟酵母的MIC为4 mg/L。两性霉素B浓度为1 mg/L时，球拟酵母完全不生长，两性霉素B对球拟酵母达到了100%抑制，故两性霉素B对球拟酵母的MIC为1 mg/L。依据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）药物耐药性的判断标准，两性霉素B>4 μg/mL、氟康唑>64 μg/mL。因此，实验结果表明球拟酵母对两性霉素B和氟康唑敏感，不具有耐药性。

2.2 溶血实验

金黄色葡萄球菌和球拟酵母在血琼脂平板上的划线生长情况见图3。

由图3可知，金黄色葡萄球菌于37 ℃培养12 h后，血平板观察到浅色溶血区，出现了明显溶血现象，球拟酵母于30 ℃培养36 h后，酵母在血平板培养基上可以正常生长，且在培养的菌株周围的琼脂中没有显示绿色，也并没有出现透明圈，表明血平板并未出现溶血现象，因此判定球拟酵母不是溶血性菌株，具有一定的使用安全性。

2.3 球拟酵母代谢物分析

2.3.1 挥发性代谢物分析

利用正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）的统计方法对数据进行分析。由图4可知，组间分离效果很好，说明加酵母组（B组）与不加酵母组（A组）代谢物差别很大，其中S-plot中实心点代表差异代谢物，球拟酵母的代谢物共15个，分为醛类、醇类、酸类、酮类、酯类、酚类，其中未发现有明显毒害作用的物质。由图5可以更直观地看出同一物质在不同组间的含量差异，加入球拟酵母后整体的风味物质相对含量都有一个较大的提升。酵母可产生乙醇，醇类与酸类会形成酯类，同时醇类也会氧化生成醛类、酸类，醇类、醛类、酸类和酯类组成酱油的香气成分。酚类物质是酱油中的典型呈味物质，对酱油的香味构成有重要的影响。还有有机酸类，它们都有特殊的芳香味，如代谢物中的棕榈酸具有天然花香，在发酵过程中被醇类和醛类氧化。醛类主要由小麦在加热处理和制曲过程中产生的酸类通过曲霉菌和酵母的作用转化而成，对酱油的香味有重大影响。酮类本身不属于风味物质，但微量的羟基化合物有果味或者焦糖香气[24]，如代谢物中的2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮，这类具有环状烯醇酮类的化合物大多具有焦糖味。它与麦芽酚等焦糖味的物质相比，具有更好的水溶性，在味觉上呈现出的甜味更加突出。

2.3.2 非挥发性代谢物分析

利用OPLS-DA的统计方法对数据进行分析，结果见图6。图6中的横坐标展示样本组间的差异，纵坐标展示样本组内的差异。由OPLS-DA得分图可知，样本都处于95%置信区间内，它的组内存在一定差异，但组间差异更加显著。对样品检测出的代谢物的相对含量进行显著性差异分析，以火山图来进一步展示两组间代谢物的差异性大小情况和代谢物的数量分布情况。以加球拟酵母组对不加球拟酵母组而言，由图7可知，两组代谢物数量众多且差异显著，灰色圆点代表两组间不具备明显差异的代谢物（not significant），蓝色圆点代表显著性下调的差异代谢物（down-regulated），而红色圆点代表显著性上调的差异代谢物（up-regulated），也就是球拟酵母的相关代谢物。

将检测到的显著差异代谢物通过分类学统计，结果见图8。由图8可知，球拟酵母的非挥发性代谢物质有苯类、苯丙烷和聚酮化合物、核苷与核苷酸类似物、有机酸及其衍生物、有机氧化合物、有机杂环化合物、脂质和类脂质分子等物质。用完全连锁方法对酵母的差异代谢物进行聚类分析，从热图中可更直观地看出同一物质在不同组间的含量差异。其中有机酸及其衍生物种类最多，多为赖氨酸类、谷氨酸类、L-肌肽等氨基酸组成，它们是提供酱油鲜味的主要物质[25]，此外，酵母自溶产生的核酸类物质也会使酱油的鲜味增强[26] 。与不加球拟酵母组相比，加球拟酵母组的糖类、醇类物质减少，可能是被酵母利用生成酯类、酸类物质。有文献指出球拟酵母在高盐条件下可以将醇类转化为酯类[27]。此外，在球拟酵母代谢物中未发现明显有毒物质。

3 结论

本文从菌株耐药性实验、溶血性实验以及其在发酵过程中的代谢组学等方面，对发酵食品用菌球拟酵母的安全性进行了初步研究。确定了球拟酵母对酮康唑、伏立康唑两种基本抗生素敏感；对氟康唑、两性霉素B存在剂量依赖性；球拟酵母不是溶血性菌株，具有一定的使用安全性；在球拟酵母挥发性与非挥发性代谢产物中均未检测出有害代谢物；此外，也显示球拟酵母是典型的酯香型酵母，对酱油的风味起到至关重要的作用。本文初步证明了球拟酵母的安全性，后续可以通过动物实验对球拟酵母的安全性进行更进一步的探究，从而为其在传统发酵食品中的应用安全性提供更加科学、全面的理论依据，对传承和发展我国传统发酵食品、促进行业健康发展有重要意义。

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