不同炮制方法下若羌灰枣主要功能成分及抗氧化活性的对比

李 爽,谢丹露,吴继周,马 瑞,谢艾迪,邵 蕾,高娟娟,韩海霞

(新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】红枣(Ziziphusjujubadates)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属植物枣树(ZiziphusjujubaMill.)的果实[1],是药食两用原料之一[2]。红枣中主要有多糖[3]、黄酮类[4]、多酚类[5]、五环三萜类[6]等功能成分,具有多方面的药理作用[7]、抗氧化[8,9]等作用,逐渐成为加工利用和天然健康食品研究的热点[10]。比较不同炮制方法对红枣功能成分及抗氧化活性的影响,对红枣的加工利用有重要意义。【前人研究进展】红枣历代就有许多炮制方法,主要为制膏、蒸制、煮制、酒炙、炒制等,而到目前为止仍然使用的有蒸制、煮制、炒制等几种炮制方法[11]。王克周[12]对红枣的炮制方法进行了研究,认为红枣通过不同方法的炮制后,红枣的水溶性成分最大限度地进入煎液,提高了红枣的利用率。【本研究切入点】炮制是指对中草药进行烘、炒、泡、蒸、煮等方法的加工,不仅能使药材洁净、矫味、干燥,而且还降低了药材的毒性,使其不易变质[13]。炮制还可以使药材的疗效增强,药材的性能发生改变,便于调剂制剂的作用[14]。红枣使用不同的炮制方法,可能使其在配方中发挥不同的功效[15]。目前,红枣经蒸、煮、炒等不同炮制方法后,其中主要活性物质含量和抗氧化活性是否不同,尚未明确。需研究不同炮制方法下若羌灰枣主要功能成分及抗氧化活性的对比。【拟解决的关键问题】以新疆红枣品种若羌灰枣为原料,采用蒸制、煮制和炒制等方法对若羌灰枣进行炮制,分析比较与灰枣生品相比,研究不同炮制方法下若羌灰枣的主要活性成分含量及抗氧化能力的不同,为采用最适宜的灰枣使用方法提供更准确的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 原料

红枣品种选用若羌灰枣,购于新疆巴州若羌县。

1.1.2 试剂

1,1二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(纯度>97%),2,2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺(ABTS)(纯度>98%)均购自于上海麦克林生化有限公司,批号:20200825;芦丁标准品(批号:153-18-4),没食子酸标准品(批号:149-91-7),福林酚(批号:NONE6060) 均购自于上海麦克林生化科技有限公司;无水乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、VC、均为分析纯,购自于天津市致远化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器

80-1电动离心机(金坛市恒丰仪器厂),KQ2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),ZWY-200D型智城恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司),T-6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 方法

1.2.1 若羌灰枣样品前处理

1.2.1.1 灰枣生品

选同一批若羌灰枣洗净,切片,85℃干燥8 h,至恒重。

1.2.1.2 蒸制品

取洁净的若羌灰枣适量,至锅内隔水蒸制0.5 h,切片,85℃干燥8 h,至恒重。

1.2.1.3 煮制品

取洁净的若羌灰枣适量,置锅内待水开后煮0.5 h,切片,85℃干燥8 h,至恒重。

1.2.1.4 炒制品

取洁净的若羌灰枣适量,置锅内炒至其外表皮破裂,表灰枣面出现焦斑,切片,85℃干燥8 h,至恒重。

1.2.2 样品溶液的制备

准确称取1 g不同炮制方法的若羌灰枣于烧杯中,向烧杯内加入75%乙醇30mL,称重后封口,并浸泡1 h,随后60℃超声提取40 min,再称定重量,加75%乙醇补足减失的重量,过滤,取滤液于4 000 r/min离心15 min,得到不同炮制方法若羌灰枣供试品溶液。

1.2.3 不同炮制方法下若羌灰枣总黄酮含量

1.2.3.1 芦丁对照品溶液制备

精密称取0.020 0 g的芦丁对照品于容量瓶中,用75%乙醇定容至100 mL,即为0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液,备用。

1.2.3.2 芦丁标准曲线绘制

参照李连芳等[13]方法绘制芦丁标准曲线。

1.2.3.3 供试品溶液的测定

分别取不同炮制方法若羌灰枣供试品溶液各2 mL,平行3份,显色反应同“1.2.3.2”方法操作,将510 nm处所测吸光度值带入回归方程,并计算含量。

1.2.4 不同炮制方法下若羌灰枣总多酚含量

1.2.4.1 没食子酸对照品溶液制备

精密称取0.010 0 g的没食子酸于容量瓶中,用蒸馏水定容至100 mL,即为0.1 mg/mL的没食子酸对照品溶液,备用。

1.2.4.2 没食子酸标准曲线绘制

参照陈叶等[16]方法绘制没食子酸标准曲线。

1.2.4.3 供试品溶液测定

分别不同炮制方法若羌灰枣供试品溶液各0.3 mL,平行3份,显色反应同“1.2.4.2”方法操作,于765 nm处所测吸光度值带入回归方程,并计算含量。

1.2.5 不同炮制方法下若羌灰枣总三萜含量

1.2.5.1 齐墩果酸对照品制备

精密称取0.005 0 g的齐墩果酸对照品,用甲醇溶解,并定容至25 mL的容量瓶中,摇匀,即得齐墩果酸对照品溶液。

1.2.5.2 齐墩果酸标准曲线绘制

参照张娜等[17]方法绘制齐墩果酸标准曲线。

1.2.5.3 供试品溶液测定

取不同炮制方法灰枣提取液0.1 mL于10 mL容量瓶中,显色反应同“1.2.6.2”方法操作,于560 nm处所测吸光度值带入回归方程,并计算含量。

1.2.6 不同蒸制时间下若羌灰枣体外抗氧化

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力

参照潘俊等[18]方法稍作改进,精密称取DPPH 0.005 0 g,加入无水乙醇溶解,超声使其充分溶解,定容至棕色容量瓶中,得到0.05 mg/mL DPPH储备液,现配现用,避光使用。分别加入2 mL不同浓度的若羌灰枣供试品溶液和2 mL的0.05 mg/mL DPPH乙醇溶液于试管中,混匀并避光,进行30 min反应后,在517 nm的波长处测定其吸光度为A1;分别加入2 mL不同浓度的若羌灰枣供试品溶液与无水乙醇2 mL于试管中,摇匀,反应后测定其吸光度为A2,分别加入2 mL的DPPH乙醇溶液和2 mL 75%乙醇溶液于试管中,混匀反应后测得其吸光度为A0。VC为阳性对照,利用“公式(1)”计算样品的DPPH自由基清除率。

(1)

式中,A1:若羌灰枣供试品溶液+DPPH乙醇溶液,A2:若羌灰枣供试品溶液+无水乙醇,A0:DPPH+75%乙醇溶液。

1.2.6.2 ABTS自由基清除能力测定

参照刘洪岩等[19]方法,用蒸馏水将2,2-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)配制成浓度为7.4 mmol/L的溶液,取上述溶液6 mL加入6 mL过硫酸钾水溶液(2.6 mmol/L),混合均匀,避光反应12～16 h,即为ABTS溶液。将ABTS溶液用无水乙醇稀释至吸光度在(0.70±0.02),为A0。取3.2 mL稀释液于试管中,加入0.8 mL若羌灰枣供试品溶液混匀,避光静止6 min,于734nm处测定其吸光度。VC为阳性对照,利用“公式(2)”计算ABTS自由基清除率。

(2)

式中,A0为ABTS溶液的吸光度,A为加样品后的吸光度。

1.2.6.3 还原力测定

参照Lee等[20]方法,取0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH = 6.6) 1 mL和1mL质量分数为1%铁氰化钾于试管中,再加入1 mL不同浓度的若羌灰枣供试品溶液,用漩涡混合器混匀,在50℃水浴锅中反应20 min,随即用流水冲至冷却。冷却后再加入1 mL质量分数为10%的三氯乙酸,混匀。取上清液2 mL,加入2 mL蒸馏水,加入0.4 mL质量分数为0.1%的三氯化铁,摇匀,于700 nm处测定吸光度,蒸馏水为空白对照,VC为阳性对照,其吸光度越大,其还原能力越强。

1.3 数据处理

测定含量测定及体外抗氧化指标时,每个指标均至少重复测定3次,实验数据用Origin-2017、SPSS-19.0 计算并分析。

2 结果与分析

2.1 不同炮制方法下若羌灰枣总黄酮含量比较

研究表明,若羌灰枣生品与蒸制品、煮制品相比,总黄酮含量存在着显著性差异(P<0.05),若羌灰枣经炮制后总黄酮含量发生变化。灰枣生品中总黄酮含量为(2.15±0.09) mg/g,灰枣经炮制后,蒸制品中总黄酮含量达到最高,为(2.56±0.07) mg/g,其次为炒制品(2.02±0.04) mg/g,煮制品中总黄酮含量最低,为(1.7±0.08) mg/g。图1

图1 不同炮制方法下若羌灰枣总黄酮含量变化

2.2 不同炮制方法下若羌灰枣总多酚含量比较

研究表明,不同炮制方法下若羌灰枣与灰枣生品相比总多酚含量存在显著性差异(P<0.05),若羌灰枣经炮制后总多酚含量均低于生品。灰枣生品中总多酚含量为(66.73±1.22) mg/g,灰枣经炮制后,煮制品中总多酚含量最高,为(52.98±0.58) mg/g,其次为炒制品(47.62±0.35) mg/g,蒸制品中总多酚含量最低,为(46±0.97) mg/g。图2

2.3 不同炮制方法下若羌灰枣总三萜含量比较

研究表明,不同炮制方法下若羌灰枣总三萜含量存在显著性差异(P<0.05)。灰枣生品中总三萜含量为(35.86±0.49) mg/g,经炮制后,蒸制品中总三萜含量最高,为(46.56±1.62) mg/g,煮制品中总三萜含量为(27.01±0.71) mg/g,炒制品中总三萜含量为(22.35±0.43) mg/g。图3

图2 不同炮制方法下若羌灰枣总多酚含量变化

2.4 不同炮制方法下若羌灰枣抗氧化比较

2.4.1 对DPPH自由基的清除能力

研究表明,在0.1～25.6 mg/mL浓度范围内,不同炮制方法灰枣对DPPH自由基的清除率随浓度的增大而增大,在0.1～1.6 mg/mL,不同炮制方法若羌灰枣对DPPH自由基的清除率呈线性增加;在1.6～25.6 mg/mL,灰枣对DPPH自由基清除率随浓度的增加而缓慢增加。在0.1～25.6 mg/mL,灰枣生品对DPPH自由基清除率的IC50为2.03 mg/mL,蒸制品IC50为1.36 mg/mL,煮制品IC50为4.97 mg/mL,炒制品IC50为2.42 mg/mL,同浓度范围VC的IC50为0.04 mg/mL。不同炮制方法灰枣对DPPH自由基有着良好的清除能力,其中蒸制品对DPPH自由基清除能力最好,但与VC对DPPH自由基清除能力相比,不同炮制方法灰枣对DPPH自由基清除能力始终低于VC。图4

图4 不同炮制方法下灰枣对DPPH自由基的清除能力变化

2.4.2 不同炮制方法对ABTS自由基的清除能力变化

研究表明,当浓度在0.125～1 mg/mL,随着浓度的不断增加,不同炮制方法灰枣对ABTS自由基的清除能力也随之增大,当浓度在0.125～0.5 mg/mL时,不同炮制方法灰枣对ABTS自由基的清除速率呈线性增加;当浓度为1 mg/mL时,蒸制品对ABTS自由基的清除率最高,达到78.68%,其次为灰枣生品(73.36%),炒制品为66.14%,煮制品清除率最低,为65.29%;而当浓度大于1 mg/mL时,对ABTS自由基清除率随浓度增加几乎不再增加;在0.125～2 mg/mL,灰枣生品对ABTS自由基清除率的IC50为0.21 mg/mL,蒸制品IC50为0.27 mg/mL,煮制品IC50为0.52 mg/mL,炒制品IC50为0.38 mg/mL,同浓度范围VC的IC50为0.09 mg/mL。不同炮制方法灰枣对ABTS自由基有着良好的清除能力,其中灰枣生品和蒸制品对ABTS自由基清除能力最好,但与VC对ABTS自由基清除能力相比,不同炮制方法灰枣对ABTS自由基清除能力始终低于VC。图5

2.4.3 不同炮制方法对灰枣还原能力的影响

研究表明,随着灰枣浓度不断的增加,反应体系的吸光度也不断增大。在0.125～2 mg/mL浓度范围内,随着浓度的增加,不同炮制方法下灰枣的还原能力也增大,表现出良好的量-效关系,但与VC的还原能力相比,灰枣及其炮制品还原能力始终低于VC,其中蒸制品总还原能力最高。图6

图5 不同炮制方法下灰枣对ABTS自由基的清除能力变化

3 讨 论

试验中若羌灰枣蒸制品中总黄酮含量高于灰枣生品,可能是因为蒸制过程中随着温度的升高,使得一些黄酮苷发生水解,产生更多的黄酮所致[21],白浩东等[22]研究发现知母经炮制后黄酮类化合物及总糖含量均升高。而煮制灰枣中总黄酮含量降低,是因为煮制过程中总黄酮类化合物溶于水中而流失。试验中煮制灰枣中总黄酮含量与灰枣生品相比,总黄酮含量由生品中(2.15±0.09) mg/g降至(1.7±0.08) mg/g,损失率达20.93%。试验中若羌灰枣经炮制后总多酚含量下降,可能是因为高温使不稳定的酚类物质发生降解,产生不同程度的降低。试验中若羌灰枣蒸制品中总三萜含量显著升高,可能是因为蒸制过程中蒸汽中水分进入灰枣内部,使总三萜有效溶出,增加了含量;煮制灰枣中总三萜含量与灰枣生品相比,总三萜含量由生品中(35.86±0.49) mg/g降至(27.01±0.71) mg/g,损失率达24.68%,与张娜等[17]的研究结果相似,干枣经蒸制后总三萜类化合物含量显著增加。

DPPH法是利用其乙醇溶液在517 nm波长处具有特征吸收峰,当加入抗氧化剂后,若出现吸光度值下降,则表示该抗氧化剂对自由基具有清除能力,因测量的简单性,迅速性和灵敏性而被广泛用于检测物质的抗氧化能力[23]。刘君等[24]研究表明黑芝麻经炮制后体外抗氧化能力增强,其中生品、蒸制品和炒制品的IC50分别为1.058、0.225、0.632 mg/mL。试验中生品、蒸制品、煮制品和炒制品对DPPH自由基清除能力的IC50分别为2.03、1.36、4.97、2.42 mg/mL,蒸制品对DPPH自由基清除能力最高。经抗氧化成分氧化后,ABTS可以生成稳定的阳离子自由基,使反应体系颜色减弱[25]。李香等[26]研究发现三颗针经炮制后其体外抗氧化能力增强。吴丰鹏等[27]研究发现黄精生品对ABTS自由基清除能力的IC50为8.71 mg/mL,黄精蒸制品对ABTS自由基清除能力的IC50为7.53 mg/mL。试验中生品、蒸制品、煮制品和炒制品对ABTS自由基清除能力的IC50分别为0.21、0.27、0.52、0.38 mg/mL,灰枣生品和蒸制品对ABTS自由基清除能力最高。还原力是指在反应过程中,氧化剂可以将铁氰化钾的三价铁还原成二价铁,进一步使反应体系的吸光度值增大,可以用A700来表示其还原力的强弱,吸光值越大,还原力将越强。试验中灰枣蒸制品的还原力最强,煮制品的还原力最弱。经不同方法炮制后灰枣其他药理作用是否也发生变化值得进一步研究。

4 结 论

若羌灰枣生品经蒸、煮、炒法炮制后,其中总黄酮、总多酚和总三萜含量都会发生不同程度的变化。蒸制品中总黄酮含量最高,为(2.56±0.07) mg/g;灰枣生品中总多酚含量最高,为(66.73±1.22) mg/g;蒸制品中总三萜含量最高,为(46.56±1.62) mg/g。除总多酚外,蒸制品中总黄酮和总三萜含量均为最高。蒸制品对DPPH自由基和ABTS自由基均有一定的清除能力,其IC50分别为1.36、0.27 mg/mL,VC对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力的IC50分别为0.04、0.09 mg/mL,若羌灰枣蒸制品对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力始终低于VC。若羌灰枣蒸制品总还原力最高,但与VC的还原能力相比,若羌灰枣蒸制品还原能力始终低于VC。