CEACAM6、miR-146b、S100A6在甲状腺癌中的表达及意义分析

赖盛联,毛 敏,黄 林

(广西壮族自治区钦州市第一人民医院甲状腺乳腺外科,广西 钦州 535000)

甲状腺癌是主要由甲状腺滤泡上皮恶变发展而来的颈部肿瘤,占全身恶性肿瘤的1%,好发于女性,男女发病比例1∶3.03,近年来甲状腺癌发病率呈快速增长和年轻化趋势[1]。大多数甲状腺癌分化程度高,生长缓慢,病死率低,但是早期易发生颈部淋巴结转移,即便接受根治手术,术后仍有较高的复发和远处转移风险[2],降低患者生存率和生存质量。明确甲状腺癌高危病变相关分子生物学标志对指导治疗、预测复发风险和预后均有重要意义。癌胚抗原相关细胞黏附分子6(carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 6,CEACAM6)是癌胚抗原家族成员,其过表达可促使细胞异常分化、抑制细胞凋亡、促使细胞生长,并增强对治疗剂的抵抗,促使癌症发生和进展[3]。miR-146b是转录后基因沉默因子,在前列腺癌、宫颈癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中表达上调,促进癌细胞生长和侵袭[4]。钙结合蛋白A6(calcium-binding protein A6,S100A6)是S100钙结合蛋白家族的成员,可促进结直肠癌、肝细胞癌、骨肉瘤和胰腺癌细胞增殖,上皮间质转化和迁移[5]。本研究拟探讨CEACAM6、miR-146b、S100A6与甲状腺癌临床病理特征以及预后的关系,以期为临床病情分析和预后判断提供参考。

1 资 料 与 方 法

1.1一般资料 选择2016年10月—2018年10月我院收治的甲状腺癌患者165例,男性41例,女性124例,年龄30～52岁(<40岁96例、≥40岁69例);病理类型:乳头状癌85例,滤泡状癌50例,未分化癌18例,髓样癌12例;肿瘤直径:>1 cm 82例,≤1 cm 83例;分化程度:低中度分化47例,高度分化118例;T分期:T1～T2期93例,T3～T4b期72例;N分期:N073例,N1a～N1b92例。纳入标准:①均行甲状腺切除手术,术后病理组织学证实为甲状腺癌,符合相关诊断流程和标准[6];②术前未接受任何形式的治疗;③临床数据完整。排除标准:①合并其他部位恶性肿瘤或血液肿瘤;②发生远处转移者;③既往颈部手术史,随访失联。

本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2方法 手术切除的癌组织以及癌旁经病理学证实的正常组织(距肿瘤组织边缘≥5 mm)新鲜标本置入液氮中冷冻保存。取组织标本室温下复融,Prime Script miRNA cDNA合成试剂盒(日本TaKaRa公司)提取组织总RNA,Transcriptor First Strand cDNA Synthesis试剂盒(瑞士Roche公司)将RNA逆转录为cDNA。取2 μL cDNA样品,采用CFX96实时荧光PCR仪(美国Bio-Rad公司)和SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix(美国Bio-Rad公司)进行实时定量荧光聚合酶链反应(quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction,qRT-PCR),以β-actin为内参,2-△△Ct计算CEACAM6、miR-146b、S100A6相对表达量。引物序列、反应条件、反应体系见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3随访 所有甲状腺癌患者出院后电话或者门诊等方式定期随访至2021年10月,随访期间患者肿瘤复发转移、死亡情况,计算总生存率,总生存时间定义为接受手术日期到因任何原因引起的死亡或随访结束时间。

1.4统计学方法 应用SPSS 22.00统计软件分析数据。计量资料采用t检验和单因素方差分析。Kaplan-Meier绘制甲状腺癌患者生存曲线,Log-Rank检验不同CEACAM6、miR-146b、S100A6表达下生存率的差异。单因素和多因素Cox比例风险模型分析影响甲状腺癌患者预后的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1癌组织和癌旁组织中CEACAM6、miR-146b、S100A6基因表达比较 癌组织CEACAM6、miR-146b、S100A6表达高于癌旁组织(P<0.05),见表2。

表2 癌组织和癌旁组织中CEACAM6、miR-146b、S100A6表达差异Table 2 Expression differences of CEACAM6, miR-146b and S100A6 in cancer tissues and adjacent tissues

2.2不同临床病理特征 CEACAM6、miR-146b、S100A6表达比较肿瘤直径>1 cm、低中度分化、T3～T4b期、N1a～N1b患者癌组织中CEACAM6、miR-146b、S100A6表达高于肿瘤直径≤1 cm、高度分化、T1～T2期、N0患者(P<0.05),其他临床病理特征间CEACAM6、miR-146b、S100A6表达比较差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 不同临床病理特征CEACAM6、miR-146b、S100A6表达差异Table 3 Expression differences of CEACAM6, miR-146b and S100A6 in different clinicopathological features

2.3Kaplan-Meier生存分析 本次随访期间死亡16例。Kaplan-Meier生存曲线分析显示CEACAM6高表达组、miR-146b高表达组、S100A6高表达组患者总生存率低于CEACAM6低表达组、miR-146b低表达组、S100A6低表达组(P<0.05),见表4,图1。

表4 不同CEACAM6、miR-146b、S100A6表达甲状腺癌患者生存率差异Table 4 Survival rate difference of thyroid cancer patients with different expressions of CEACAM6, miR-146b and S100A6 (例数,%)

2.4Cox比例风险模型分析预后的影响因素 以甲状腺癌患者随访期间预后生存情况为因变量(死亡=1,存活=0),纳入年龄(连续变量)、性别(男性=0,女性=1)、肿瘤大小(≤1 cm=0,>1 cm=1)、分化程度(高度分化=0,低中度分化=1)、T分期(T1～T2期=0,T3～T4b期=1)、N分期(N0=0,N1a～N1=1)、CEACAM6(低表达=0,高表达=1)、miR-146b低表达=0,高表达=1)、S100A6低表达=0,高表达=1)为自变量。多因素Cox比例风险回归分析显示N1a～N1b、CEACAM6高表达、miR-146b高表达、S100A6高表达是甲状腺癌患者不良预后的危险因素(P<0.05),见表5。

图1 不同CEACAM6、miR-146b、S100A6表达甲状腺癌患者生存曲线图

表5 影响甲状腺癌患者预后的多因素Cox回归分析Table 5 Multivariate Cox regression analysis of factors affecting prognosis of thyroid cancer patients

3 讨 论

甲状腺癌是发病率最高的头颈部肿瘤以及临床最常见的内分泌系统恶性肿瘤,其发病原因和发病机制复杂多样,确切病因尚难肯定,但是综合流行学调查、肿瘤实验性研究以及临床观察发现目前已知的有辐射污染、碘摄入过量或不足、甲状腺疾病、肥胖、吸烟史、女性、基因突变、心理因素等等[7-8]。多数甲状腺癌患者手术切除后可获得长期的生存,但是术后易复发,不同组织学类型甲状腺癌预后差异较大,且目前缺乏对高侵袭性甲状腺癌的有效治疗手段[9],因此探寻甲状腺癌发生的关键生物标志物有助于预后评估,更好的指导临床治疗,改善患者预后。

CEACAM6是癌胚抗原家族中多功能、高度糖基化的细胞黏附蛋白,通常在上皮细胞表面和骨髓细胞表面表达,参与相邻细胞间或细胞外基质和细胞间黏附,在胚胎发生、神经组织发育、炎症、免疫细胞迁移和免疫反应中发挥重要作用[10]。CEACAM6还可介导其他癌胚抗原家族成员间结合以及与整联蛋白受体结合,调节信号传导,其异常表达与恶性肿瘤发生密切相关[11]。现有研究[12]显示CEACAM6过表达可激活蛋白激酶/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信号通路促使透明细胞肾细胞癌细胞侵袭和转移,在喉鳞状细胞癌中CEACAM6启动子区域的DNA高甲基化,导致其表达下调,且CEACAM6低表达与喉鳞状细胞癌疾病进展有关[13],在口腔鳞状细胞癌中,CEACAM6通过与表皮生长因子受体相互作用激活细胞内信号级联传导,促进癌细胞侵袭和转移[14]。本研究发现CEACAM6在甲状腺癌中表达明显增高,且与甲状腺癌大小、分化程度、T、N分期有关,生存分析显示CEACAM6高表达者生存率低于CEACAM6低表达者,Cox回归分析显示CEACAM6高表达是甲状腺癌预后不良的危险因素,表明CEACAM6在甲状腺癌中可能发挥致癌基因作用,CEACAM6过表达与甲状腺癌发生进展有关,CEACAM6可作为甲状腺癌预后评估的潜在指标。

miR-146b是一种多功能miRNA,可调节先天性和适应性免疫和炎症反应,还具有调节各种肿瘤细胞分化、增殖和迁移的作用,在结肠癌、乳腺癌和黑色素瘤等多种人类癌症中发挥肿瘤抑制基因或癌基因作用[15]。现有研究[16]显示miR-146b通过靶向磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路抑制前列腺癌自噬,增强其增殖和生长活力,miR-146b-3p在宫颈癌组织中上调,通过直接靶向15-羟基前列腺素脱氢酶增强细胞增殖、迁移[17],miR-146b-5p还可诱导白色脂肪组织褐变并加速脂肪分解,减少脂肪量,导致恶病质[18]。本研究发现miR-146b在甲状腺癌中表达上调,且与甲状癌增大、低中分化、TN晚分期以及低生存率有关,表明miR-146b过表达可能促使甲状腺癌进展。分析机制为miR-146b可靶向抑制其下游基因PTEN的表达,激活磷酸肌醇3-激酶(Phosphoinositol 3-kinase,PI3K)/AKT信号通路,促使甲状腺癌细胞增殖[19]。

S100A6是一种钙调蛋白,位于人类染色体1q21,可调节细胞骨架蛋白动力学,细胞增殖、分化,钙代谢等,还参与PI3K/AKT、Wnt/β-连环蛋白、p38/丝裂原活化蛋白激酶和核因子κB等多种信号通路调节,与人类多种恶性肿瘤发生和发展密切相关[20]。S100A6在宫颈癌细胞中表达升高,S100A6过表达通过激活PI3K/AKT信号通路,增加宫颈癌细胞的增殖和迁移[21],在结直肠癌中S100A6通过促使癌细胞中钙周期蛋白结合蛋白Ca2+依赖性核易位,促使癌症进展。本研究结果显示S100A6在甲状腺癌中表达上调,S100A6过表达与甲状腺癌恶性侵袭行为以及预后不良有关。分析原因为:PI3K/AKT信号通路在甲状腺癌发病机制中发挥重要作用,PI3K、AKT磷酸化在促进甲状腺癌细胞增殖中起关键作用,S100A6过表达可激活PI3K/AKT信号通路,继而促使甲状腺癌细胞恶性增殖,导致肿瘤进展。

综上所述,甲状腺癌组织中CEACAM6、miR-146b、S100A6表达均增高,CEACAM6、miR-146b、S100A6高表达与甲状腺癌体积增大、低中分化、晚T、N分期以及预后不良有关,可作为甲状腺癌的潜在指标。本研究局限之处在于尚不能直接证实CEACAM6、miR-146b、S100A6在甲状腺癌的致癌基因作用,尚待进一步开展基础研究证实。