鹿茸菇母种培养基条件优化及其菌丝显微观察

陈华 黄彩翔 郭月仙 林怡 王义祥 刘朋虎

摘 要：为进一步了解鹿茸菇的生物学特性，筛选其适宜的母种培养基配方，设置了不同碳源、氮源、pH和温度条件的筛选试验，观测鹿茸菇菌丝生长情况和菌丝显微结构。结果表明：鹿茸菇母种培养基菌丝生长最适碳源为淀粉，最适氮源为硝酸钠，最适pH值为7.0，最适菌丝生长温度为25℃，鹿茸菇菌丝为双核细胞，有锁状联合，其细胞较长，不同生长时期隔膜明显度不同。

关键词：鹿茸菇；母种培养基；细胞核；显微观察

中图分类号：S 646.9   文献标志码：A   文章编号：0253-2301（2023）02-0022-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.02.004

Abstract： In order to further understand the biological characteristics of Lyophyllum decastes and select the appropriate formula of mother culture medium， the screening tests of different carbon sources， nitrogen sources， pH and temperature conditions were set up to observe the mycelial growth and microstructure of Lyophyllum decastes. The results showed that the optimum carbon source was starch， the optimum nitrogen source was sodium nitrate， the optimum pH was 7.0， and the optimum temperature for the mycelial growth was 25℃. The mycelium of Lyophyllum decastes was a binuclear cell with clamp connection. Its cells were longer， and the visibility of cell membrane was different at different growth stages.

Key words： Lyophyllum decastes； Mother culture medium； Cellular nuclear； Microscopic observation

鹿茸菇學名为荷叶离褶伞Lyophyllum decastes，因其外形与鹿茸相似，故取名鹿茸菇[1]。鹿茸菇肉质厚实、口感脆滑，具有很高的食用和药用价值，可以抑制癌细胞生长[2]，降低血糖、血压等[3]，具有很好的应用前景。20世纪90年代日本首次室内栽培鹿茸菇，从2000年开始大量生产，2004年在日本宝酒造株式会社首次实现无覆土栽培[1]。国内许多学者先后对野生荷叶离褶伞子实体进行分离、人工驯化。1973年李植森曾利用蕨台和茅草为培养料在林地内仿野生栽培研究[4]；2005年李林玉等[5]也对荷叶离褶伞菌丝营养条件进行了初步研究；2006年魏生龙等[6]利用PDA培养基上获得了其子实体；2007年上海丰科生物科技股份公司首次在中国成功实现了荷叶离褶伞菌（FLd1）的工厂化栽培[7]，但还存在着发菌期较长、单瓶产量偏低的缺点。之后，随着工厂化栽培技术的成功发展和管理技术的逐渐成熟，鹿茸菇产量稳步增长。但由于鹿茸菇菌种难以维持，菌种迅速退化，导致栽培产量下降。此外，由于不同来源的鹿茸菇菌株其生长条件和生长速度有所差异，为了缩短鹿茸菇菌株的菌丝生长周期，提高鹿茸菇工厂化生产水平，探索其适宜培养条件，缩短栽培周期，提高栽培产量仍是未来研究的重点。为此，本研究通过对鹿茸菇菌丝生长最适碳源、氮源、pH和温度等条件筛选以及菌丝显微观察展开研究，旨在明确鹿茸菇的生物学特性和其工厂化栽培技术的优化提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试鹿茸菇菌株为Lyophyllum decastes LRX，来自宁德市益智源农业开发有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基配方 PDA培养基的配方为马铃薯40 g、蔗糖4 g、NaNO3 0.2 g和琼脂4 g。

1.2.2 碳源配方筛选 试验共选取7种碳源，分别为麦芽糖、蔗糖、玉米粉、淀粉、红糖、白糖和果糖。试验时配制含20 g·L-1的7种碳源PDA基础培养基，分别分装于试管中，并尽量使装入的培养基液面保持相同高度，从而得到相同长度的培养斜面。121℃下高压蒸汽灭菌20 min，然后摆斜面。冷却后将活化好的母种菌丝，以相等的接种量接种到不同碳源斜面培养基上，每种碳源接5根试管，做好标记。25℃下恒温、避光培养复苏，待菌丝在培养基上生长后，同一天给不同碳源画一条基准线，继续培养20 d，期间每隔5 d画一次线，观察和记录这20 d的生长情况，包括长势、色泽、平均生长速度，比较不同碳源的生长情况。

1.2.3 氮源配方筛选 氮源配方筛选是在基础培养基中分别添加1 g·L-1的酵母粉、牛肉浸膏、谷氨酸、NH4Cl、NaNO3作为氮源，每种氮源重复5次。参照1.2.2进行接种和生长情况观察。

1.2.4 最适pH筛选 试验共设pH4、5、6、7、8和9等6个水平，每个处理重复5次。试验基础培养基选用的碳源、氮源分别为蔗糖和NaNO3。利用1 mol·L-1 NaOH或1 mol·L-1 HCl调节培养基至相应的pH条件，然后参照1.2.2的方法进行接种和生长情况观察。

1.2.5 最适温度筛选 试验设19℃、22℃、25℃、28℃、29℃、30℃和31℃等7个温度条件，基础培养基同pH筛选试验，每个处理重复5次。接种后分别放在不同温度的培养箱中避光培养，待复苏后对不同温度培养下的菌丝在同1 d画一条基准线，继续培养20 d，期间每隔5 d画一次线，记录20 d的生长速度和生长情况。

1.2.6 菌丝细胞核数量观察 将鹿茸菇菌种接种在插有盖玻片的平板培养基上避光培养，待菌丝爬上盖玻片的1/3面积后，即可通过DAPI染料染色，然后在正置荧光显微镜下观察菌丝的细胞核数量。

1.3 数据分析

试验数据采用Excel 2010软件进行数据处理；采用SPSS 19.0软件中Duncan多重性方法分析不同处理间的差异显著性，数据均为5个重复的平均值±标准偏差（平均值±SD，n=5，显著P<0.05，极显著P<0.01）。

2 结果与分析

2.1 碳源对鹿茸菇菌丝生长的影响

由表1、图1可知，鹿茸菇菌丝对8种碳源均能利用，菌丝均呈现出稠密，洁白，但也存在一定的差异。不同碳源对鹿茸菇菌丝的生长速度影响不同，依次为麦芽糖>淀粉>玉米粉>蔗糖>葡萄糖>白糖>红糖>果糖。麦芽糖作为碳源菌丝生长速度最快，但菌丝的稠密度不及淀粉；淀粉作为碳源菌丝生长速度第2，但从菌丝的生长稠密程度上看是最密的，麦芽糖与淀粉作为碳源菌丝生长速度差异不显著；玉米粉作为碳源菌丝的生长速度较快，但菌丝生长较稀疏；蔗糖、葡萄糖、白糖、红糖作为碳源菌丝的生長速度差异不显著；果糖作为碳源菌丝的生长速度最慢。综上，淀粉作为碳源对鹿茸菇菌丝生长是最佳的。

2.2 氮源对鹿茸菇菌丝生长的影响

由表2、图2可知，鹿茸菇菌丝对NaNO3、牛肉浸膏、酵母粉、谷氨酸、NH4Cl这5种氮源都能利用，菌丝生长速度依次为NaNO3>牛肉浸膏>酵母粉>谷氨酸>NH4Cl。从菌丝的疏密程度上看，以NaNO3为氮源菌丝最密；牛肉浸膏和酵母粉为氮源菌丝的疏密程度比NaNO3稍差；以谷氨酸、NH4Cl为氮源的菌丝生长缓慢，但菌丝较为密集。NaNO3、牛肉浸膏作为氮源菌丝生长速度显著高于其他3种，综合菌丝生长速度和疏密程度，NaNO3作为氮源对鹿茸菇菌丝生长是最佳的。

2.3 pH对鹿茸菇菌丝生长的影响

由表3、图3可知，鹿茸姑菌丝在pH值为4、5、6、7、8、9的培养基上都能生长，其中pH值为7时生长速度最快，菌丝生长浓密，洁白，棉絮状，整齐，不往试管壁上生长；pH值为6时菌丝生长浓密，洁白，棉絮状，向试管壁上生长严重；pH值为8时菌丝生长较为浓密，洁白，棉絮状，较整齐，菌丝向试管壁上生长较严重；pH值为9时菌丝生长浓密，洁白，棉絮状，整齐，菌丝往试管壁上生长的程度较轻；pH值为5时菌丝生长较稀疏，白色，棉絮状但不是很明显，往试管壁上生长的程度较轻；pH值为4时由于培养基凝固程度不高，菌丝生长稀疏，白色，往试管壁上生长严重。综上，培养基pH值为7时最适鹿茸姑菌丝生长。

2.4 温度对鹿茸菇菌丝生长的影响

由表4、图4可知，鹿茸菇菌丝在供试温度中，生长状况最好的是25℃，致死温度是31℃ ，该品种鹿茸菇不适宜超过29℃的高温下生长。25℃下菌丝生长速度最快，且菌丝浓密；22℃下菌丝生长速度比25℃下的生长速度慢，菌丝浓密；19℃下菌丝生长速度比22℃下的生长速度慢，且其菌丝的浓密程度也比不过22℃下生长的菌丝浓密；菌丝在28℃下的生长速度明显有所下降，但菌丝生长仍浓密；29℃和30℃下生长的菌丝，前期能够萌发生长，但10 d后可以明显地看到接种块有些发黄，菌丝生长速度缓慢。

2.5 鹿茸菇菌丝细胞核数量观察

菌丝是食用菌的营养器官，通过分解吸收营养物质、水分、无机盐类和有机物质等供给自己生长发育。菌丝细胞又是食用菌的基本组成单位，也是菌种鉴别的重要参考依据。由图5可知，鹿茸菇菌丝是双核细胞，有锁状联合，其细胞较长，不同生长时期隔膜明显度不同。通过5 ug·mL-1 DAPI染料染色，在正置荧光显微镜40倍物镜下观察菌丝的染色情况，可以在目镜中看到细胞核发蓝色至浅绿色荧光，有时会发黄色荧光，原因是稀释DAPI染料的磷酸盐缓冲液会随DAPI染料进入菌丝细胞中，细胞中的多聚磷酸颗粒与DAPI结合，在紫外激发光下会发黄色荧光。

3 讨论与结论

碳源、氮源、pH和温度等均是食用菌菌丝生长的营养因子，为了简化配方筛选指标，大多研究者选择碳氮比作为配方筛选的关键因子进行研究，易忽略pH和温度指标对菌丝生长的影响。鹿茸菇栽培起步晚，栽培技术不够完善，生物学特性研究不够健全，需要进一步加大基础性指标研究。因此，通过碳源、氮源、pH和温度等生长因子的筛选对基础研究具有重要参考价值。本试验从碳源配方筛选中得出，麦芽糖配方菌丝生长速度最快，淀粉配方第2与麦芽糖配方菌丝长速无显著差异，但淀粉配方菌丝色泽和长势优于麦芽糖配方。有研究表明，淀粉作为碳源添加于培养基中，对榆干离褶伞、羊肚菌和杏鲍菇菌丝长势发挥重要作用[8-10]。从氮源配方筛选中得出，鹿茸菇菌丝对有机氮和无机氮均能利用，结果表明无机氮NaNO3更适合鹿茸菇菌丝生长，有机氮中牛肉浸膏菌丝生长效果最好。周会明等[11]对荷叶离褶伞配方筛选表明，菌株ZY01、ZY02及ZY03的最适碳源是蔗糖，最适氮源是蛋白胨，而菌株ZY04和ZY05最适碳源是葡萄糖，最适氮源是蛋白胨。说明不同菌株对碳源和氮源的需求具有差异性。鹿茸菇属中温型菌类，菌丝在19～30℃下均能生长，且随着温度的提高，生长速度出现“低促高抑”趋势，25℃下菌丝生长速度最快，菌丝色泽洁白，长势最密；在31℃下培养，菌丝停止生长。pH在6～8范围内生长较好，pH为7时是最佳酸碱度。鹿茸菇菌丝生长温度与张凌姗[12]的研究较为一致，而pH略有差异。

在观察鹿茸菇菌丝细胞核过程中，其菌丝生长时间会影响到观察结果，一般培養10 d左右为宜。观察时尽量将视野移动到菌丝尖端位置，由于菌丝尖端分裂旺盛，更可能观察到完整细胞和里面的细胞核。另外，在利用正置荧光显微镜观察时，每次使用的时间需控制在1～2 h，因为超过90 min后，超高压汞灯发光强度会逐渐下降，发出的荧光减弱。同时，标本局部受到紫外线照射3～5 min后，荧光也会明显减弱，需要不停地移动观察。整个标本的观察时间在40 min左右荧光会淬灭。不同浓度的DAPI染料，其穿透性不同，因此需要根据不同样本选择不同的浓度，染色出来的荧光才清晰。食用菌菌丝具有锁状联合，都可以判断为双核菌丝，但并不是所有的双核菌丝一定具有锁状联合结构[13]。本研究通过荧光显微镜观察发现，鹿茸菇菌丝属于双核菌丝，并有锁状联合结构发生，一方面为工厂化栽培鹿茸菇奠定了理论基础，另一方面丰富了鹿茸菇生物学特性及开展杂交育种、优良菌株筛选提供参考。

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（责任编辑：柯文辉）