小麦DREB4蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

李永波　鲁琳　方会见　崔德周　孟福燕　黄琛　隋新霞　樊庆琦　楚秀生

关键词：小麦：非生物胁迫：DREB4转录因子：多克隆抗体

中图分类号：S512.1：Q786 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023） 03-0009-06

干旱、盐、高温、冷等各种非生物胁迫会严重影响小麦产量。DREB蛋白含有一个保守的AP2结构域，可以和顺式作用元件DRE核心序列（A/GCCGAC）发生特异性结合，通过在转录水平上调控下游基因的表达，进而应对各种非生物胁迫。到目前为止，DREB转录因子在拟南芥、大豆、水稻、玉米、大麦和小麦等多种植物中被鉴定出来。DREB分为六大类（DREB1～6），其中，DREB1在拟南芥、水稻、玉米中主要应答冷胁迫，DREB2主要应答干旱、盐胁迫，DREB3参与ABA和糖信号途径，DREB4应答干旱、冷胁迫及在乙烯与茉莉酸途径中起作用，DREB5参与应答干旱、冷胁迫，DREB6应答干旱、盐胁迫。大量研究已验证了DREB在植物应对非生物胁迫中的功能。如在小麦中过表达拟南芥DREBIA、大豆GmDREB1或棉花Gh DREB基因，可通过提高根系活力、光合作用及渗透调节能力提高小麦的抗旱性；在拟南芥中过表达大豆GmDREB2、GmDREB3或小麦Ta DREB3基因，可提高拟南芥抗旱、耐盐、耐高温及抗冻性；过表达GmDREB6基因，可增强大豆的耐盐能力。

然而，目前几乎所有关于DREB的研究是集中在转录水平上的调控，缺乏蛋白质水平上的调控研究，且DREB蛋白发挥生物学功能是否通过磷酸化、乙酰化等蛋白水平上的调控尚未可知，因此，研究识别内源性DREB蛋白的特异性多克隆抗体，对于DREB在蛋白水平的调控研究具有非常重要的意义。

本研究通过对小麦中已有的DREB4A、4B和4C进行序列分析，选取DREB4A进行原核表达、纯化，并以其作为抗原，首次制备出可识别小麦内源DREB4蛋白的多克隆抗体，以期为进一步研究植物DREB4在蛋白水平上的调控机理提供方法学基础。

1材料与方法

1.1试验材料

供试小麦品种为济麦379，由山东省审定（鲁审麦20210017）。取其幼苗期根、叶为材料进行试验。

1.2 DREB4序列分析与合成

本研究通过DNAMAN8软件对NCBI中提交的DREB4A（AY781354.1）、4B（AY781355.1）和4C（AY781356.1）序列进行分析；DREB4A序列的合成由北京擎科生物科技有限公司进行。

1.3 DREB4A载体构建、原核表达及纯化

将上述合成的DREB4A序列与大肠杆菌表达载体PET30a通过同源重组的方法（pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit，CU201-02，北京全式金生物技术股份有限公司）连接，将连接产物转入DH5α（北京擎科生物科技有限公司）感受态细胞中，冰上放置15 min.42℃水浴热激90s，再冰上放置2 min，加入1 mL无任何抗生素的LB液体培养基，37℃、210r/min水平摇th，然后取100μL菌液，涂于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。挑取10个单克隆进行PCR检测，选取2个阳性信号最强的单克隆由北京擎科生物科技有限公司进行测序，对测序正确的单克隆进行摇菌、质粒提取（质粒小提试剂盒，DP103，北京天根生化科技有限公司）。将提取好的质粒转入B121（ DE3）感受态细胞（CD701-02，北京全式金生物技术股份有限公司）中，剩余步骤同DH5a感受态细胞转化。挑单克隆，置于5 mL LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后吸取1 mL菌液，加入到300 mL LB液体培养基中进行扩大培养，待菌液OD值为0.6～0.8时，加入终浓度为50 mmol/L的IPTG（G5042-1G，武汉塞维尔生物科技有限公司）进行诱导表达，28℃过夜培养；菌液于6000 r/min离心10 min，收集菌体沉淀，用1×PBS（ phosphate buffer saline）清洗沉淀1次，然后加入40 mL lxPBS重悬，超声破碎（开3s，关3s；共计30 min），6000 r/min离心10min，分别将沉淀、上清液进行SDS电泳检测。利用His标签蛋白纯化试剂盒（P2226，上海碧云天生物技术有限公司）对上清液进行纯化，然后置于透析袋中4℃过夜透析，将透析后的蛋白置于-20℃保存备用。

1.4小麦DREB4多克隆抗体制备

选取实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各1只，饲养体重至1～2 kg时，用注射器将充分混匀的1mL完全弗氏佐剂（液体石蜡：羊毛脂=2：1）和0.3 mg DREB4A融合蛋白对每只兔子进行皮下注射第1针，标记为第1天；第12天，将充分混匀的1 mL不完全弗氏佐剂（完全弗氏佐剂+终浓度20 mg／mL的卡介苗）和0.15 mg融合蛋白对每只兔子进行皮下注射第2针；第26天，将充分混匀的1 mL不完全弗氏佐剂和0.15 mg融合蛋白对每只兔子进行肌肉注射第3针；第40天，将充分混匀的1 mL不完全弗氏佐剂和0.15 mg融合蛋白对每只兔子进行肌肉注射第4针：第53天，取兔子血清进行Western blot验证。

1.5 Western blot分析

利用植物组织蛋白裂解液提取小麦幼苗期根、叶部的总蛋白（植物蛋白提取试剂盒，CW0885，康为世纪生物技术有限公司），配制15%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳：通过湿法转膜，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素薄膜上，然后将膜放人含有2%脫脂奶粉的TBS（25 mmol/LTris-HCl，137 mmol/L NaCl）中，封闭1h；加入DREB4多克隆抗体（1：1000稀释于2%脱脂奶粉中），4℃过夜；用TBST（TBS+20%吐温-20）洗涤3次后，向封闭液中加入碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）标记的二抗，缓慢摇动24 h，然后TBST洗涤3次，每次10 min;最后用发色液（TBS 10 mL，5% NBT 45μL，5% BCIP 35μL）进行发色。

1.6免疫组织化学法进行亚细胞定位

将小麦叶片下表皮撕下，置于4%多聚甲醛中，室温放置24 h，弃掉多聚甲醛，用1×PBS清洗3次，加入2%脱脂奶粉于37℃封闭30 min，然后在4℃下加入DREB4多克隆抗体（1：200稀释于2%脱脂奶粉中）过夜；用PBS洗涤3次后，加入1μL二抗（山羊抗兔-Alexa Fluor 555抗体）和10mL BSA，37℃继续孵育th，然后用TBS清洗3次，在室温下用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DA-PI，AnaSpec Inc.， San Jose， CA，USA）染色10 min，然后用TBS清洗3次，置于荧光显微镜（HT7700，Hitachi，Tokyo，Japan）下观察并拍照。

2结果与分析

2.1小麦DREB4序列分析

在普通小麦中，DREB4存在DREB4A、4B、4C三种转录本，其中，DREB4A编码394个氨基酸，分子量为42.8 kDa；DREB4B編码346个氨基酸，分子量为37.7 kDa；DREB4C编码68个氨基酸，分子量为7.1 kDa（图1）。三个蛋白氨基酸序列的保守性为61.28%，第1～25位的氨基酸完全一致，其中，DREB4B除第26～73位氨基酸缺失外，其它位置的氨基酸与DREB4A完全一致。DREB4A、4B和4C存在序列间的差异，可能是应对不同非生物胁迫产生的可变剪切所致。

2.2小麦DREB4A的原核表达

鉴于DREB4A的氨基酸序列最长，选其进行后续分析。首先，将人工合成的DREB4A序列与表达载体PET30a连接后，在大肠杆菌中进行表达，上清液中的蛋白纯化后进行SDS -PAGE检测。结果显示，在大约50 kDa处出现清晰的蛋白条带（图2），与预期的蛋白分子量相符，表明DREB4A成功表达。

2.3 DREB4多克隆抗体的制备

本研究以上述获得的纯化DREB4A融合蛋白为抗原免疫兔子，从兔血清中获取了DREB4多克隆抗体。Western blot结果显示，该抗体在目的蛋白位置清楚地识别到DREB4A蛋白（图3）。

2.4 DREB4多克隆抗体对小麦内源性DREB4蛋白的识别及特异性检测

为了进一步验证该抗体能否识别小麦内源性DREB4蛋白，分别提取小麦苗期根、叶总蛋白进行免疫识别。Westem blot结果显示，仅在37 kDa处检测到清晰的蛋白条带，这与预测的DREB4B蛋白分子量一致（图4）。表明该抗体可以识别小麦内源性DREB4B蛋白，而且特异性好，可以用于后续植物DREB分子机理的相关研究。

2.5 DREB4亚细胞定位分析

DREB4定位于细胞核中（图5），与前人报道的DREB转录因子核定位的结果一致，进一步证实了该抗体特异性较好，可用于开展免疫组织或细胞化学研究的可行性。

3讨论与结论

DREB是一类抗非生物胁迫的转录因子，目前主要用于抗逆转基因植物的培育及相关分子机理的解析。小麦DREB4蛋白是一种对动物和人类无危害的蛋白，将其用于粮食作物抗逆性转基因改良有着广阔的市场前景。DREB4在小麦中存在三种转录形式（DREB4A、4B和4C），其中，DREB4A编码的多肽链最长，涵盖的蛋白信息最丰富，推测由此蛋白作为抗原产生的抗体可识别DREB4的所有三种形式，因此本研究利用DREB4A蛋白作为抗原，进行了DREB4多克隆抗体的制备。经过抗原上清蛋白的纯化、免疫注射，最终研制出能识别小麦内源性DREB4蛋白的多克隆抗体。

尽管从植物中已克隆出多种类型的DREB基因，但由于其抗体类型匮乏以及识别内源性蛋白抗体的空白，导致有关DREB在蛋白水平上的调控机理研究进展相对缓慢。目前，只有拟南芥DREBIA的抗体制备成功，且仅对大肠杆菌中表达的拟南芥DREBIA融合蛋白进行了检测。本研究首次开发了特异性识别小麦内源DREB4蛋白的多克隆抗体，既丰富了植物DREB的抗体类型，也为进一步推动DREB在蛋白水平上的研究提供了方法学基础。

利用本研究制备的DREB4多克隆抗体检测小麦苗期根、叶内源性DREB4蛋白时，仅识别到了DREB4B蛋白条带，与预测的该抗体能识别小麦中DREB4三种蛋白形式的结果不一致，这可能是因为DREB4具有组织器官以及不同发育阶段表达特异性，在小麦苗期根、叶中主要以DREB4B的形式表达，而在花、籽粒等其它组织器官以及不同发育阶段中则以其它形式表达；另外，DREB4在不同小麦品种中的表达形式也可能存在一定的差异，本研究所用小麦品种济麦379为抗旱节水型品种，在其苗期根、叶中主要以DREB4B的形式表达，但在其它类型的小麦品种中以哪种形式表达还有待进一步研究。

传统DREB基因亚细胞定位是采用构建DREB-GFP过表达载体转入组织或细胞中的方法进行定位，而本研究是利用该抗体对内源DREB4进行免疫定位，与传统方法相比可避免因过表达造成目的蛋白移位的现象。

综上所述，本研究通过对DREB4A进行大肠杆菌表达、纯化，并以此作为抗原成功制备出可识别小麦内源性DREB4蛋白的高度特异性多克隆抗体，可为深入研究植物DREB4在蛋白水平上参与非生物胁迫的调控机理奠定方法学基础。