高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉与保健食品中维生素B12的含量

李莲 林洁娜 罗雪婷

摘 要：建立高效液相色谱法检测婴幼儿配方奶粉与保健食品中维生素B12的分析方法。选择SB-AQ柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）作为色谱柱，流动相为0.025%三氟乙酸溶液+乙腈，流速1.0 mL·min-1，梯度洗脱，进样量100 μL，检测波长361 nm。保健品：B族维生素片等样品采用水提取的方式；基质复杂的样品用固相萃取的方法。婴幼儿配方奶粉：含量＜4 μg/100 g的样品用固相萃取法，含量≥4 μg/100 g的样品用直接提取方式，经高效液相色谱仪分析。结果表明，维生素B12标准溶液线性良好，r2＞0.999，加标回收率在86.2%～96.0%，RSD为1.3%～1.8%，检出限为0.4 μg/100 g。该方法简便快捷，所用试剂耗材少，灵敏度高，结果准确。

关键词：高效液相色谱法；维生素B12；婴幼儿配方奶粉；保健食品

Abstract： To establish a low-cost and efficient HPLC method for the determination of vitamin B12 in infant formula milk powder and health food.SB-AQ column （4.6 mm×250 mm， 5.0 μm） was selected as the chromatographic column with mobile phase consisting of 0.025% trifluoroacetic acid solution + acetonitrile at the flow rate of 1.0 mL·min-1. The sample size was 100 μL and the detection wavelength was 361 nm. Health care products： samples such as B vitamin tablets are extracted by water; samples with complex matrix are extraction method. Infant formula milk powder： sample content＜4 μg/100 g with solid phase extraction method， sample content ≥4 μg/100 g with direct extraction method， and they were analyzed by HPLC. The results showed that the standard solution curves of vitamin B12 were liner with r2＞0.999， the recovery rate of spiked were 86.2%～96.0%， and the RSD were 1.3%～1.8%. The detection limit was 0.4 μg/100 g. The method was simple and fast， low cost， high sensitivity， and relatively accurate.

Keywords： high performance liquid chromatography; vitamin B12; infant formula; health food

维生素B12（VB12）是一类含有钴离子的咕啉类化合物总称，化学式为CoC63H88N14O14P，溶于乙醇、甲醇以及水，pH值为4.5～5.0时较为稳定。维生素B12主要以辅酶形式参与各种代谢过程，参与某些化合物的异构化作用；促进人体中脂肪、蛋白质等物质的新陈代谢；参与制造红细胞的产生，并加速细胞的生长发育，防止恶性贫血、老年痴呆、抑郁症等疾病。维生素B12是人体所必需且不能自身合成的重要营养物质，人體可通过摄入动物源食品来获取，包括鱼、肉、家禽、鸡蛋和牛奶等，日常补助量约2.4 μg，孕期、哺乳期的女性可提高到2.6 μg，婴儿为0.4 μg。正常成年人对其需要量可通过合理饮食得到补充，特殊群体可摄入功能性成分食品进行补充，但不可过量，过量或可引发哮喘、湿疹等过敏反应[1-3]。

维生素B12的结构极为复杂，有5-脱氧腺苷钴胺素、羟基钴胺素、甲基钴胺素、氰钴胺素等，自然环境下，前3种物质为微生物合成VB12的最终形式，但性质不稳定，氰化钾或氰化钠可将天然形式的VB12转化成更稳定的氰钴胺素。传统意义的VB12则是指氰钴胺素，而氰钴胺素通常作为食品添加剂被添加到保健食品以及婴幼儿乳粉中，起到补充VB12的目的，但需要严格控制添加量。因此，高效及准确定量VB12尤为重要。经过多年探索，有关VB12的检测方法从最初的步骤烦琐、工作量大的微生物法发展到快速又准确的酶联免疫法，但酶联免疫法成本较高，因此又衍生出了包括高效液相色谱法在内的各种检测方法，本文建立了较为快速、简单的高效液相色谱法检测婴幼儿配方奶粉以及保健食品中VB12含量的方法[4-5]。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

乳清蛋白粉，市售；B族维生素片中VB12定量分析质控样品1，婴幼儿奶粉中VB12定量分析质控样品2，中国检验检疫科学研究院测试评价中心；5批婴幼儿配方奶粉[样品1，澳优爱优（1段）；样品2，爱他美卓（2段）；样品3，佳贝艾特（3段）；样品4，乐铂（1段）；样品5，诺优能（3段）]，市售；6批保健品（样品1：太阳神牌B族维生素片；样品2：欣笙禾维生素营养食品；样品3：济维他牌维生素B片；样品4：白芸豆综合果蔬酵素粉；样品5：电解质固体饮料；样品6：千舒配方营养粉），市售；标准物质：VB12（CAS：68-19-9），FirstStandard公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），上海星可高纯溶剂有限公司；无水乙醇（分析纯），天津市康科德科科技有限公司；盐酸（分析纯）、磷酸（分析纯），广州化学试剂厂；乙酸钠（分析纯）、硫酸锌（分析纯）、乙酸锌（分析纯）、氢氧化钠（分析纯），天津福晨化学试剂有限公司；实验中所用的水为一级水。

净化柱：DIKMA-Proelut PLS固相萃取柱（150 mg），迪马科技公司；高效液相色谱仪（配DAD检测器），美国Agilent公司；AutoEVA-60型全自动平行浓缩仪，厦门睿科仪器有限公司；台式离心机，北京博励行仪器有限公司；超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；漩涡混合器，德国IKA公司；电子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司。

1.2 标准溶液配制

准确称取标准品10 mg，用乙醇溶解并定容至10 mL，转移棕色瓶冷冻保存6个月，其浓度为1 000 μg·mL-1。由于保健食中VB12的含量较高，可配制标准溶液浓度为0.1 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1；而婴幼儿配方奶粉中VB12的含量较低，可配制标准溶液浓度为5 ng·mL-1、10 ng·mL-1和25 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和150 ng·mL-1。标准溶液均用水配制。

1.3 试样前处理

1.3.1 保健食品试样前处理

（1）直接提取法。称取已制备好的试样2.000 g到50 mL容量瓶中，加25 mL水，涡漩2 min，用1 mol·L-1盐酸调pH值至4.0～4.5，于40 ℃超声30 min，加水定容。取样液10 000 r·min-1离心5 min，上清液过0.45 μm水膜，待测。此法用于检测基质简单的B族维生素片中VB12的含量。

（2）固相萃取法。固相萃取柱用5 mL甲醇活化，再用5 mL水平衡，吸取10 mL用直接提取法制備的上清液过柱，等样液滴完，依次用5 mL水、5 mL 0.2%的磷酸溶液淋洗柱子，弃去流出液，用5 mL甲醇洗脱并收集净化液到氮吹管中，40 ℃氮吹至干，1 mL水复溶，过0.45 μm水膜，待测。此法针对多成分、基质复杂的保健食品。

1.3.2 婴幼儿配方奶粉试样前处理

（1）直接提取法。称取5.000 g样品于250 mL锥形瓶，加40 mL 0.1 mol·L-1盐酸溶液，充分摇匀，塞上软质塞子，高压灭菌锅中121 ℃保持30 min，冷却至40 ℃以下取出，冷却至室温，用10 mol·L-1的氢氧化钠溶液调节pH值至4.0～4.5，转移至50 mL容量瓶，用水定容。取样液于10 000 r·min-1离心5 min，取上清液过0.45 μm水膜，待测。此法用于处理婴幼儿配方奶粉中VB12含量高于4 μg/100 g的样品。

（2）固相萃取法。操作过程同保健品固相萃取法一致。此法用于处理婴幼儿配方奶粉中VB12含量低于4 μg/100 g的样品。

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-Aq反向色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；检测波长：361 nm；进样量：100 μL。流动相条件详见表1。

2 结果与分析

2.1 样品前处理优化

2.1.1 保健品基质

（1）B族维生素片。B族维生素片成分简单，用水、甲醇、50%甲醇、乙醇作为提取试剂进行前处理，其他过程不变，实验中选择3种B族维生素片以及质控样进行处理，每个方法2个平行，处理结果见表2。结果发现，水和50%的甲醇结果较接近样品标签值，纯甲醇不能完全提取，乙醇提取均未出峰，考虑试剂环保问题，本文选择水作为前处理提取试剂。

（2）基质复杂的保健品。针对复合营养素、原料中添加较高含量碳酸钙、明胶等的复合片及固体饮料等，水直接提取不能准确定量VB12的含量，杂峰较多，影响最大吸收光谱，而选择固相萃取柱法进行试样富集、净化，可准确定量基质复杂的保健品中VB12。本文选择3种样品，用水提取和固相萃取柱法进行处理，结果见表3，对比发现固相萃取柱法的结果更接近样品标签值。

2.1.2 幼儿配方奶粉基质

婴幼儿配方奶粉中的蛋白质对VB12的测定结果有较大影响，故沉淀蛋白是最重要的环节。本文分别选择加入5 mL 0.5 mol·L-1乙酸钠溶液、0.5 mol·L-1乙酸锌溶液、0.5 mol·L-1硫酸锌溶液、乙醇溶液，以及在高压灭菌锅中121 ℃保持30 min，结果显示添加溶液沉淀蛋白的效果不理想，离心后未澄清；而高压灭菌后离心，样液完全澄清，但婴幼儿配方奶粉中VB12含量特别低，以此进行前处理（不加溶液直接高压灭菌），样品浓度在5～10 ng·mL-1，很考验普通紫外检测器，含量低于4 μg/100 g的样品，不易准确定量，而选择固相萃取法可将样品浓度提高至50～150 ng·mL-1，适用于长期检测，方法稳定性好。

本文选取了5批婴幼儿奶粉以及质控样，按上述过程进行处理，每个试样平行两份，结果如表4所示。VB12含量低于2 μg/100 g的样品用水直接提取，结果为未检出，而使用固相萃取法，回收率可达90%。图1、图2为奶粉基质的两种前处理方式的色谱图，直接提取的样品响应较低，杂峰较多，固相萃取法样品峰形完美。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

选择实验室现有的SB-C18、SB-Aq以及AQ-C18 3种类型的反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），通过多次调整以及参考国标法[6-7]确认最适合的色谱条件，具体出峰情况及相关信息详见表5。分析可知，选择SB-Aq色谱柱以及0.025%三氟乙酸-乙腈进行梯度洗脱，两个基质均出峰，且耗时较短。

2.2.2 检测波长的选择

用浓度为1 μg·mL-1的VB12标准溶液，用DAD检测器3D通道扫描，测定最大吸收光谱，波长扫描范围为200～600 nm。如图3所示，VB12在361 nm处有较大吸收峰，出峰情况良好，因此本文两种基质均选择361 nm作为检测波长。

2.2.3 流速与柱温的选择

实验中选择0.5 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1 3个常用流速作为参考，其他条件不变。比较发现，流速为0.5 mL·min-1时不能出峰，0.8 mL·min-1时出峰相对较慢，峰形对称性不佳，柱效较差，1.0 mL·min-1时的图谱见图1、2，出峰时间与峰形相对适宜，故本文选择流速1.0 mL·min-1。

本文研究了柱温（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃）对保健品和乳粉中VB12检测效果的影响。结果发现，温度较低时，目标峰与杂质峰的分离度不好，有拖尾出现；50 ℃时目标物峰面积会减小；综合考虑，选择柱温40 ℃可满足保健品和乳粉中VB12的检测。

2.3 线性范围、检出限、回收率、精密度

以VB12浓度为横坐标（x），对应的峰面积为纵坐标（y），分析标准溶液浓度线性关系，保健品的线性方程为y=38.46x+8.978 7，r2=0.999 6；婴幼儿奶粉的线性方程为y=0.085 7x+0.230 5，r2=0.999 3，线性良好。由于保健品中VB12含量较高，因此本文选择婴幼儿奶粉基质来确定仪器检出限，当信噪比S/N=3时，基线噪音为0.020 mAU，样品峰高为0.060 mAU，对应样品浓度为4 ng·mL-1，因此检出限为0.4 μg/100 g。

对于加标回收实验，保健品使用了实验室现有的不含有VB12的固体饮料，乳粉选择了乳清蛋白粉进行加标，按表6中3个水平加标，平行6份，按照固相萃取柱的方法进行前处理。由表6可知，保健品的VB12加标回收率在87.9%～96.0%，RSD在1.5%～1.8%；乳粉的VB12加標回收率在86.2%～95.3%，RSD在1.3%～1.7%，均符合GB/T 27404—2008[8]附录F中回收率和精密度的要求，表明该方法的准确度和精密度良好，可满足实验需求。

3 结论

本文建立了高效液相色谱法检测婴幼儿配方奶粉与保健品中VB12的分析方法，样品前处理根据基质的性质选择了直接提取法与固相萃取法，得出VB12标准溶液线性良好，r2＞0.999，检出限为0.4 μg/100 g，检测结果与样品标示值较为接近，整个实验过程花费时间较少。表明该方法简便快捷、成本低、结果准确。

参考文献

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[3]谢璐瑶，王变，马康，等.中国常见食物维生素B12含量[J].中国食物与营养，2018，24（2）：73-76.

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[5]李贻，王晓洁，卞菲菲，等.高效液相色谱法检测婴幼儿配方食品中维生素B12的含量[J].食品安全质量检测学报，2021，12（8）：3306-3312.

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[7]国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 食品中维生素B12的测定：GB 5009.285—2022[S].北京：中国标准出版社，2022.

[8]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.实验室质量控制规范 食品理化检测：GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.