梨矮化砧木‘中矮1号’离体培养中褐化 现象的抑制研究

崔文宁 朱淑新 孟静静 王灿 王茜 王芳芳

摘 要： 【目的】褐化是植物组织培养中酚类物质被氧化成黑褐色的醌类物质的过程，是影响植物组织培养中愈伤组织诱导率的关键影响因素，该试验是为了研究不同类型的防褐剂对其的抑制效果，并为后续‘中矮1号的离体快繁研究解决瓶颈问题。【方法】试验采用AgNO 3、活性炭（AC）、Na 2S 2O 3、聚乙烯吡络烷酮（PVP）、抗坏血酸（维生素C）5种防褐剂对‘中矮1号叶片进行防褐化研究。【结果】相比CK组，添加防褐剂可有效缓解组培过程中外植体的褐化情况。其中，维生素C处理组的防褐效果最好，褐化率均在50.00%以内，0.05 g/L的维生素C抗褐化效果最佳，褐化率仅为18.75%；8.0 g/L的PVP效果最差，褐化率高达71.25%，且培养基受浸染褐化严重。【结论】褐化现象的产生有内外多重因素，包括外植体的基因型、母体年龄、取材部位、取材时间及大小等，褐色物质在培养基中的积累也是导致外植体褐变率增加的一个重要因素，MS和1/2MS等固体培养基不利于醌类等毒害物质的扩散，而且会导致其短时间内毒素高浓度聚积，更加剧了外植体的褐化。

关键词： 梨；砧木；中矮1号；褐化；防褐剂

文章编号：2096-8108（2023）03-0008-03  中图分类号：S661.2  文献标识码：A

Study on Browning Inhibition in Vitro Culture of Dwarf Rootstock of ‘Zhongai 1

CUI  Wenning，ZHU  Shuxin，MENG  Jingjing，WANG  Can，WANG  Qian，WANG  Fangfang

（School of Life Science， Hengshui University， Hengshui 053000， China）

Abstract： 【Objective】Browning is a process of phenolic substances being oxidized into black-brown quinones， which is a key factor affecting the induction rate of callus in plant tissue culture. This experiment is conducted to study the inhibition effect of different types of anti-browning agents， and to solve the bottleneck problem for the subsequent in vitro rapid propagation research of ‘Zhongai 1. 【Methods】AgNO 3， activated carbon （AC）， Na 2S 2O 3， polyvinylpyrrodanone （PVP） and ascorbic acid （vitamin C） were used to prevent the browning of ‘Zhongai 1 leaves. 【Results】Compared with CK， browning control agent can effectively alleviate the browning of plants in tissue culture. Among them， VC had the best anti-browning effect， the browning rate was all less than 50.00%， and 0.05g/L VC had the best anti-browning effect with a lowest rate of 18.75%. 8.0 g/L PVP was the worst， the Browning rate was highest with a rate of 71.25%， and the medium was seriously stained， too. 【Conclusion】 The browning phenomenon is caused by multiple internal and external factors， including the genotype of explants， maternal age， sampling site， sampling time and size， etc. The accumulation of brown substance in the medium is also an important factor leading to the increase of the browning rate. Solid medium such as MS and 1/2MS is not conducive to the diffusion of toxic substances such as quinones. Moreover， it will lead to the accumulation of high concentration of endotoxin in a short time， which will aggravate the browning of explants.

Keywords： pear； rootstock; Zhongai 1; browning; anti-browning agent

‘中矮1號是中国农科院果树研究所从‘锦香梨的实生苗后代选育出来的第1代优良矮化砧木，东方梨的栽培种亲和性好，矮化作用明显，大大促进了我国梨的矮砧密植栽培和设施化栽培的发展，具有巨大的社会效益。但其自根繁殖困难，离体组织扩繁是其有效的繁殖途径之一。苹果、梨等蔷薇科植物多酚类物质含量高，多酚氧化酶活性强，组织培养过程中外植体褐化现象严重，目前已有很多相关的研究报道  ［1-3］ 。褐化是指在植物组织培养过程中，组织中的酚类物质被氧化成黑褐色的醌类物质的过程  ［4］ 。褐化现象是影响植物组织培养中愈伤组织诱导率的关键影响因素  ［5］ ，虽然关于植物组培中褐化的研究很多，也取得了一些进展，但关于‘中矮1号离体组培的相关研究还未见报道。试验以‘中矮1号叶片为试材，首次较系统的研究了不同类型的防褐剂对其抑制效果研究，拟为后续‘中矮1号的离体快繁研究解决瓶颈问题。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料选自河北省武邑县现代农业示范园区‘中矮1号梨砧木种质资源圃。

1.2 试验方法

于2022年4月中旬清晨采集‘中矮1号中度成熟叶片（展叶15 d左右，绿色），放于500ml大烧杯中，带回实验室后用自来水流水冲洗，在不破损叶片的前提下，用软毛牙刷轻轻刷掉叶片上的灰尘和小绒毛，然后流水冲洗1 h，随后用1%的吐温加洗衣粉水溶液完全浸泡叶片5～10 min，随后再用自来水流水冲洗1 h，最后用0.1%的HgCl 2浸泡消毒10～15 min。

试验采用单因素平行试验设计。防褐剂选取AgNO 3（0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、 0.3 mg/L 、 0.5 mg/L 、1.0 mg/L）、活性炭AC（0.05 g/L、0.1 g/L、 0.2 g/L 、0.3 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L）、Na 2S 2O 3（0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、 5.0 mg/L 、10.0 mg/L）、聚乙烯络烷酮PVP（0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、 5.0 g/L 、8.0 g/L）、维生素C（0.05 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L），设置不添加任何防褐剂处理做对照。消毒完毕的梨叶片剪成 1 cm 2 小块接种于培养基上，每处理接种20瓶，每瓶4个外植体，3次重复。

所有试验均采用MS培养基，于高压灭菌锅121℃高温灭菌20 min，接种后每隔1 d同一时间统计叶片褐化情况，14 d后试验结束。

褐化率=发生褐化的外植体数/接种的外植体数×100%，所得数据用Excell和DPS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 AgNO 3对褐化率的影响

接种1 d后外植体开始出现褐化，3 d后褐化增多，但褐化处表面无褐色物质出现（详细情况详见表1）。14 d后统计褐化率可知，较低浓度的AgNO 3对‘中矮1号叶片的褐化抑制情况较明显， 随着AgNO 3浓度增加，褐化率增加。0.1 mg/L的处理防褐效果最好，叶片褐化率最低为22.50%， 1.0 mg/L 的处理褐化最严重，褐化率最高为47.50%。

2.2 AC对褐化率的影响

AC处理当天外植体即出现褐化现象，3 d后褐化严重，褐化部位表面颜色加深，第7天时出现褐色物质。由表2可知，14 d后0.2 g/L的AC对 ‘中矮1号叶片的防褐效果最好，褐化率为28.75%，表面无褐色物质出现。其他处理组防褐效果依次为0.05 g/L>0.1 g/L> 0.3 g/L>0.5 g/L>1.0 g/L。

2.3 Na 2S 2O 3对褐化率的影响

接种当天开始出现褐化，第2天时褐化迅速加剧，第14天试验结束时，大部分外植体褐化部位边缘已出现褐色沉积物，培养基接触部位已被浸染成黄褐色。由表3可知：所有Na 2S 2O 3处理的抗褐化效果都不算太好。相比来说，0.5 mg/L的处理组抗褐化效果最佳，为30.00%；10.0 mg/L的处理效果最差，高达61.25%。

2.4 PVP对褐化率的影响

PVP处理组接种当天即有部分出现褐化情况，第7天时1.0 g/L处理组外植体褐化边缘出现褐色物质沉积，14 d时有些已完全褐化、死亡。由表4可以看出，PVP的抗褐化效果随着浓度的增加越来越差，0.5 g/L的PVP处理组抗褐化效果最佳，为25.00%；8.0 g/L的处理组效果最差，高达71.25%，且部分培养基已被严重褐化浸染。

2.5 维生素C对褐化率的影响

维生素C处理当天仅有少量外植体边缘出现褐化现象，第3天时褐化情况逐渐加剧，第14天试验结束时，维生素C处理组的外植体褐化情况是最轻的。由表5可知：维生素C所有处理组的褐化率都在50.00%以内，0.05 g/L的抗褐化效果是最好的，为18.75%，且没有整个外植体完全褐化的现象；随着维生素C浓度的增加，褐化逐渐严重。

2.6 CK的褐化率

不添加任何防褐剂的3个重复组褐化现象都很严重，接种当天即出现大部分褐变，第5天时大部分完全褐化死亡，第14天结束时，褐变率都在60.00%以上，最高可达76.25%，且大部分培养基受褐色物质侵染。由此可见，防褐剂的添加对‘中矮1号叶片组培中的褐变抑制效果明显。

3 结果与分析

褐化现象是蔷薇科植物组织培养中常见问题，酚类物质被氧化产生的醌类物质会对外植体产生毒害作用，导致愈伤组织褐变并影响细胞代谢  ［6］ ，所以，解决褐化问题是组培成功的关键。文晓鹏等  ［7］ 在刺梨的愈伤组织诱导研究中发现，培养基中添加一定浓度的AC可以有效控制刺梨褐化的产生；在本试验中，添加了防褐剂处理的褐化情况都相比对照有所减轻，褐变时间和程度也有所延迟。 AgNO 3、AC和维生素C处理组的褐化率都在50.00%以内，其中以维生素C 0.05 g/L的抗褐化效果是最好的，为18.75%，且没有整个外植体完全褐化的现象，是最佳的防褐剂。本研究结果和高疆生  ［8］ 在‘新梨7号组培快繁研究中的结果是一致的。

褐化现象的产生有内外多重因素，与外植体的基因型、母体年龄、取材部位、取材时间及大小等都有密切关系  ［9］ 。另外，褐色物质在培养基中的积累也是导致外植体褐变率增加的一个重要因素  ［10］ ，在本试验中也是很明显的一个褐变现象。MS和1/2MS等固体培养基不利于醌类等毒害物质的扩散，导致其短时间内毒素高浓度聚积，更加剧了外植体的褐化，所以，更换液体培养基的研究将会作为下一步工作的重点。

中文致谢

参考文献

［1］  陈 蕾，曹后男，宗成文，等.降低苹果梨组织培养过程中外植体褐化的研究［J］.北方园艺，2008 （10）：139-142.

［2］  张 永庆，陈大明，金勇丰，等.桃离体组织分化再生植株的研究［J］.园艺学报，2001，28（4）：342- 344.

［3］  周 广志，鲁敏，安华明.刺梨果实发育过程中主要活性物质含量及其抗氧化性分析［J］.食品科学，2018，39（22）：20-25.

［4］  王 森，谢碧霞.梨果肉褐变机理和防褐变技术的研究［J］.北方果树，2004（5）：4-7.

［5］  刘 庆昌，吴国良.植物细胞组织培养［M］.北京：中国农业大学出版社，2003：39.

［6］  饶 慧云，邵祖超，柳海宁，等.抗褐化对葡萄愈伤组织继代培养过程中酚类物质/相关酶及其基因表达的影响［J］.植物生理学报，2015，51（8）：1322-1330.

［7］  文 晓鹏.刺梨离体培养/遗传多样性分析及RGA克隆的研究［D］.武汉：华中农业大学，2003.

［8］  高 疆生，張卫芳，欧勇慧，等，影响新梨7号组培快繁因子研究［J］.北方果树，2003（3）：4-6.

［9］  谢 志亮，吴振旺.木本植物组培褐变研究进展［J］.中国南方果树，2013，42（5）：42-46.

［10］  陈 蕾，曹后男，宗成文，等.降低苹果梨组培过程中外植体褐化的研究［J］.北方园艺，2008（10）： 139-142.