基于HPLC-QAMS法多成分含量测定结合化学计量学评价半夏天麻丸质量的研究

陈壁娜　黄益穗　骆月姫

〔摘要〕 目的 建立多指標结合化学计量学综合分析半夏天麻丸成分质量及关键指标的方法，为其质量评价提供科学依据。方法 采用高效液相色谱一测多评（high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker， HPLC-QAMS）法建立12批半夏天麻丸11种成分含量测定方法，运用SPSS 26.0和SIMCA 14.0软件对以上指标进行聚类分析（clustering analysis， CA）、主成分分析（principal component analysis， PCA）及偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discriminant analysis， PLS-DA），通过对12批产品的分析，综合评价半夏天麻丸质量及标志性成分。结果 建立的11种成分含量测定方法稳定性较好。CA分析可将12批样品聚为三大类，2个主成分可代表11种成分92.142%的信息量，可用2个主成分对半夏天麻丸进行综合评价。根据PLS-DA结果分析，造成其质量差异的指标为橙皮苷、天麻素、柚皮芸香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和巴利森苷，可能是影响半夏天麻丸产品质量的差异性标志物。结论 本实验首次建立了半夏天麻丸多指标成分质控方法，该方法易操作，重复性与稳定性良好；化学计量学手段也为半夏天麻丸质量控制研究提供了参考依据。

〔关键词〕 半夏天麻丸；多指标成分；高效液相色谱一测多评法；相对校正因子；化学计量学；综合质量评价

〔中图分类号〕R284       〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.016

Quality evaluation of Banxia Tianma Pill by multi-component content determination

using HPLC-QAMS and chemometrics

CHEN Bi'na， HUANG Yisui LUO Yueji

Department of Pharmacy， The First Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou，

Guangdong 510405， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To establish a method for the quality and key indexes of Banxia Tianma Pill （BXTMP） by multi-index combined with chemometrics to provide a scientific basis for its quality evaluation. Methods High performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker （HPLC-QAMS） was used to establish a method for the determination of 11 components content in 12 batches of BXTMP. The quality and iconic components of 12 batches of BXTMP were determined and analyzed by SPSS 26.0 and SIMCA 14.1 software for clustering analysis （CA）， principal component analysis （PCA）， and partial least squares-discriminant analysis （PLS-DA）. Results The determination methods of 11 components were stable. The results showed that the 12-batch samples were classified into three categories by CA， two principal components could account for 92.142% of the information content of 11 components， and two principal components could be used for the comprehensive evaluation of BXTMP. According to PLS-DA， the quality differences were caused by hesperidin， gastrodin， naringin， mullein isoflavone glucoside and parishin. These components may be the differential markers affecting the quality of BXTMP. Conclusion The quality control method of multi-index components of BXTMP was established for the first time. The method is easy to operate， with good repeatability and stability. Chemometrics also provides a reference for the quality control of BXTMP.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Banxia Tianma Pill; multi-index component; high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker; relative correlation factor; chemometrics; comprehensive quality evaluation

半夏天麻丸收载于《中华人民共和国药典（2020版）》一部[1]，由黄芪、天麻、陈皮、法半夏、人参、黄柏等12味药材配方，能健脾祛湿、化痰息风，主要用于眩晕、头痛、如蒙如裹、胸脘满闷的脾虚湿盛、痰浊内阻。现代研究表明，半夏天麻丸可使缺血性脑血管病患者体内前列环素I2水平显著升高，同时降低血栓素A2水平，使脑血流灌注指标平均通过时间显著缩短，显著升高脑血容量、脑血流量[2]。目前，关于半夏天麻丸已有临床应用[2]、工艺处方[3]研究，未检索到与该制剂检验分析相关的文献，现行标准[1]中仅对陈皮成分橙皮苷进行了定量控制。近年来，高效液相色谱一测多评（high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker， HPLC-QAMS）法[4-5]和化学计量学[5-7]的多指标评价[8]模式越来越多地应用于中药复方制剂质控研究中。本实验选取半夏天麻丸君药天麻所含主要成分天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷，臣药黄芪所含黄酮类成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和7，2'-二羟基-3'，4'-二甲氧基异黄烷，臣药陈皮所含主要成分柚皮芸香苷、橙皮苷和川陈皮素为指标性成分，同时以制剂中含量适中，色谱峰出峰时间居中，质量稳定的天麻素作为内参物，采用HPLC-QAMS法对以上11种成分含量同时进行测定，并与外标法（external standard method， ESM）结果进行比较，同时通过化学计量学[聚类分析（clustering analysis， CA）、主成分分析（principal component analysis， PCA）及偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discriminant analysis， PLS-DA）]等方法探究多指标成分含量数据间潜在的内在的关系，找出影响质量差异的主要针对性成分，旨在为半夏天麻丸整体质量控制提供依据。

1 材料

1.1  试药

对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、天麻素、橙皮苷和川陈皮素（中国食品药品检定研究院，批号：111920-201907、110807-202010、110721-202019、112055-202102，含量均高于95.3%）；7，2'-二羥基-3'，4'-二甲氧基异黄烷（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y31D10H107318，含量98.0%）；芒柄花素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷和柚皮芸香苷（成都普瑞法科技开发有限公司，批号：PRF8032146、PRF9010943、PRF9061142、PRF9061143、PRF9061141、PRF9062802，含量均高于97.1%）；半夏天麻丸（太极集团四川绵阳制药有限公司，规格：每100丸重6 g，批号：2002001、2002002、2005003、2007004、2007005、2102001、2103002、2105003、2110008、2111009、2201001、2201002，编号依次为S1～S12）；甲酸、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

1.2  仪器

UltiMate 3000型高效液相色谱仪（美国戴安公司）；Waters e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；液相色谱柱：Hedera ODS-2柱（江苏汉邦科技有限公司）、Thermo BDS C₁₈柱（美国赛默飞世尔公司）和Durashell C₁₈柱（艾杰尔科技有限公司）；XSE205DU型电子分析天平[梅特勒托利多科技（中国）有限公司]。

2  方法与结果

2.1  混合对照品溶液的制备

精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、7，2'-二羟基-3'，4'-二甲氧基异黄烷、天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷、柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素对照品适量，用60%甲醇制成各成分质量浓度分别为0.236、0.410、0.128、0.472、0.506、0.152、0.374、0.960、4.872、9.890、1.192 mg·mL-1的混合母液。再将此母液用60%甲醇稀释20倍得混合对照品溶液。

2.2  供试品溶液的制备

精密称定半夏天麻丸细粉约1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加60%甲醇25 mL，称重，加热回流1 h，常温放至室温，60%甲醇补重，摇匀过滤，即得。取按其处方工艺制备的缺黄芪、缺天麻和缺陈皮的阴性供试品各适量，按“2.1”项方法制得供试品溶液。

2.3  色谱条件及专属性试验

色谱柱为Hedera ODS-2，柱温30 ℃，流速1.0 mL·min-1；波长切换：254 nm（0～22 min检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和7，2'-二羟基-3'，4'-二甲氧基异黄烷）[9-12]、220 nm（22～44 min检测天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷）[13-17]和283 nm（44～75 min检测柚皮芸香苷、橙皮苷和川陈皮素）[18-21]；0.1%甲酸-乙腈（B）梯度洗脱（0～10 min，13.0% B；10～19 min，13.0%→17.0% B；19～44 min，17.0%→26.0% B；44～63 min，26.0%→62.0% B；63～75 min，62.0%→13.0% B），进样量为10 μL。理论板数按各成分色谱峰计，均高于4500。在上述色谱条件下进样混合对照品溶液及供试品溶液，记录色谱图（图1）。图谱显示半夏天麻丸供试品溶液中11种成分与相邻色谱峰分离良好（分离度均≥1.5）；阴性无干扰。

2.4  多指标成分测定

2.4.1  标准曲线方程的绘制  精密吸取“2.1”项混合母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分别用60%甲醇稀释至20 mL，得序号为1～6的混合对照品溶液，按“2.3”项色谱条件分别进样检测，以上述11个对照品质量浓度为横轴，峰面积为纵轴建立标准曲线。详见表1。

2.4.2  精密度、重復性与稳定性考察  取同一份半夏天麻丸（编号：S1）供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下，不间断进样6次，记录色谱峰峰面积，计算得出各成分峰面积的RSD值为0.56%～1.32%（n＝6），表明精密度良好。取半夏天麻丸（编号：S1），按“2.2”项方法制备6份供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下检测，用外标法计算11种成分的含量，得出含量的RSD值为0.96%～1.89%（n＝6），表明方法的重复性良好。取一份半夏天麻丸（编号：S1）供试品溶液，于0、2、5、9、16、24、36 h在“2.3”项色谱条件下进样检测，记录色谱峰峰面积，得出11种成分峰面积的RSD值为0.52%～1.38%（n＝7），表明配制的半夏天麻丸供试品溶液36 h内稳定。

2.4.3  准确度考察  精密称取半夏天麻丸（编号：S1）细粉0.5 g，分别按相当于各成分含量80%、100%、120%的3个水平加入混合对照品溶液（11种对照品质量浓度分别为0.137、0.206、0.065、0.241、0.269、0.084、0.191、0.572、3.612、8.095、0.796 mg·mL-1），再按“2.2”项制法配制供试品溶液，每个水平3份，在“2.3”项色谱条件下检测，结果各成分的平均加样回收率（n＝9）及RSD分别为97.98%（1.37%）、98.59%（1.42%）、96.90%（1.47%）、100.03%（0.71%）、99.42%（1.11%）、96.87%（1.57%）、98.79%（0.99%）、99.66%（1.17%）、100.11%（0.69%）、99.65%（1.26%）和98.98%（0.84%）。

2.5  HPLC-QAMS法建立

2.5.1  相对校正因子（f）的计算  分别精密吸取“2.4.1”项6个混合对照品溶液，在“2.3”项色谱条件下检测，以天麻素为内参物，按照公式f_k/s=f_k/f_s=（W_k/A_k）/（W_s/A_s）=（W_k×A_s）/（W_s×A_k）（其中f、W、A、k和s依次代表相对校正因子、质量浓度、峰面积、其他待测成分和内参物）分别计算其他10种成分的f。详见表2。

2.5.2  耐用性考察  本试验考察了液相色谱仪和色谱柱的变化、柱温的变化、流速的变化对各待测成分f的影响。结果提示，不同色谱仪（UltiMate 3000型和e2695型）和不同色谱柱（Hedera ODS-2柱、Thermo BDS C₁₈柱和Durashell C₁₈柱）时，f的耐用性良好（表3）；柱温为25、30、35 ℃时，f的耐用性良好（表4）；流速为0.8、1.0、1.2 mL·min^-1时，f的耐用性良好（表5）。

2.5.3  色谱峰定位  本试验以天麻素为内参物，考察其他待测成分在不同品牌HPLC仪和不同品牌色谱柱上相对保留时间的RSD波动。结果提示，在相同的色谱条件下，不同品牌HPLC仪（UltiMate 3000型和e2695型）和不同色谱柱（Hedera ODS-2柱、Thermo BDS C₁₈柱和Durashell C₁₈柱），各待测成分的相对保留时间的RSD均小于2.0%。详见表6。

2.6  HPLC-QAMS与ESM结果比较

取12批半夏天麻丸（S1～S12），依法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样，首先运用ESM法计算半夏天麻丸中11种成分的含量，再采用HPLC-QAMS法，运用表2中的f值计算各组分含量（表7）。采用SPSS 26.0软件对每个成分的2种方法所得数据进行t检验，结果P＞0.05，表明两种方法无显著性差异，HPLC-QAMS法可用于半夏天麻丸中11种成分的含量测定。

2.7  CA

采用SPSS 26.0统计软件对表7中HPLC-QAMS法测定结果进行CA，得聚类树状图（图2）。结果表明，当间距为10时，12批半夏天麻丸样品聚为三大类，S7、S8和S6为一类，S2、S5、S3、S4和S1为一类，S10、S11、S9和S12为一类。

2.8  PCA

采用SPSS 26.0统计软件对表7中HPLC-QAMS法含量数据进行PCA（表8—9）。由PCA结果可知，前2个主成分的累积贡献率为92.142%，其中主成分1占68.984%，主成分2占23.159%；由特征向量可知，第一主成分综合了芒柄花素、7，2'-二羟基-3'，4'-二甲氧基异黄烷、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、柚皮芸香苷、橙皮苷和川陈皮素的信息，第二主成分综合了毛蕊异黄酮葡萄糖苷、天麻素和巴利森苷的信息。同时应用统计软件SIMCA 14.1建立PCA模型（图3），共提取出2个主成分R²X＝0.921，Q²＝0.809，均大于0.5，说明所建立的模型稳定性较高。从图3可以看出，S1～S5、S6～S8以及S9～S12分别呈现一定的关联性。

2.9  PLS-DA

为进一步比较12批半夏天麻丸，寻找类间差异性指标，将表7中HPLC-QAMS法含量数据导入SIMCA 14.1统计软件，运行PLS-DA程序，得图4。结果累积解释能力参数R²X＝0.971、R²Y＝0.823，预测能力参数Q²为0.743，理论上R²Y、Q²數值越接近1，代表模型越好，通常两者高于0.5时提示所建立的模型稳定可靠、预测能力好。根据模型中各变量重要性投影（variable importance in projection， VIP）预测值来筛选类间差异性指标。一般认为在95%的置信区间内VIP＞1.0的指标在分类中发挥着重要作用，筛选出半夏天麻丸化学成分差异的标志性成分5个成分（VIP>1）（图5），即成分10（橙皮苷，VIP=1.905）、成分4（天麻素，VIP=1.274）、成分9（柚皮芸香苷，VIP=1.270）、成分1（毛蕊异黄酮葡萄糖苷，VIP=1.155）、成分8（巴利森苷，VIP=1.052）对半夏天麻丸样品质量的影响较大，可能是影响半夏天麻丸产品质量的主要潜在标志物。

3 讨论

3.1  含量测定指标的选择

半夏天麻丸由黄芪、天麻、陈皮、法半夏、人参、黄柏等12味药材配方，其中半夏和天麻均为治风痰眩晕、痰厥的良药，共为君药；人参、黄芪、白术健脾益气，苍术、陈皮健脾燥湿，茯苓、泽泻健脾渗湿，7味合用，以去痰源，共为臣药，佐以六神曲、麦芽、黄柏。诸药相合共奏健脾祛湿、化痰息风之效。本实验依托中药质量标志物原则，选取君药天麻、臣药黄芪和陈皮为考察对象，对它们所含成分进行分析，确定以天麻所含主要成分天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷，黄芪所含主要有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和7，2'-二羟基-3'，4'-二甲氧基异黄烷，陈皮所含代表性成分柚皮芸香苷、橙皮苷和川陈皮素为指标，采用HPLC-QAMS法兼波长切换法对以上11种成分进行含量测定。

3.2  供试品溶液处理方法的确定

本试验在制备供试品溶液时，首先考察了提取溶剂：50%甲醇、60%甲醇、甲醇和稀乙醇，结果发现60%甲醇提取时，所测11种成分的提取率相对较高。接着以提取率为指标，对不同提取方式（超声提取1 h、加热回流提取1 h）进行考察，结果发现回流提取时，11种成分的提取率最高，超声提取时，杂质较多，干扰正常检测。进而对提取时间0.5、1、1.5、2 h进行考察，发现提取1 h时，各成分的提取率最高，杂质最少，随着提取时间的延长，杂质增加，对含量检测造成干扰。综合考虑，最终确定以60%甲醇回流提取1 h为半夏天麻丸供试品最佳提取方式。

3.3  结果评价

本实验采用两种方法（外标法和一测多评法）测定半夏天麻丸中11种成分含量，通过比较，两种方法无显著性差异（P＞0.5）。本文验证了HPLC-QAMS法的可行性，也为降低检验成本及制剂检测多指标成分提供了实验基础。化学计量学在对12批样本数据进行处理时快速、全面地对样品进行归类，梳理相关性与差异性，利用CA和PCA互相验证，发现批间关联性和差异性。选取特征值大于1的公因子为主成分，结果前2个主成分特征值分别为7.588和2.547，累计方差贡献率为92.142%，12批半夏天麻丸聚为三大类，第一主成分综合了芒柄花素、7，2'-二羟基-3'，4'-二甲氧基异黄烷、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、柚皮芸香苷、橙皮苷和川陈皮素的信息，第二主成分综合了毛蕊异黄酮葡萄糖苷、天麻素和巴利森苷的信息。通过数据分析，以VIP＞1.0为指标找出橙皮苷、天麻素、柚皮芸香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和巴利森苷等成分可能是影响半夏天麻丸产品质量的主要潜在标志物，为药企在今后生产该制剂时指明方向。提示生产企业应关注上述成分所对应原药材进厂控制标准、制剂生产过程中各成分转化率等数据的收集，通过不断探索，完善原药材内控标准，优化细化生产过程参数控制，有效地将产品质量控制与临床疗效研究成果相结合，为临床合理用药提供数据支持。

本试验采用HPLC-QAMS法建立了半夏天麻丸11种指标成分定量质控模式，对市场流通的12批不同阶段生产的样品进行检测，又通过化学计量学识别模式对多指标成分含量检测结果进行综合分析，发现影响产品质量差异性的主要物质性成分，以期最大限度地保证半夏天麻丸的质量。

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