基于HPLC-QAMS多指标成分定量与化学计量学的延丹胶囊质量评价研究

华阳　谢飞　周虹　李志明

〔摘要〕 目的 采用高效液相色谱一测多评（high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single marker， HPLC-QAMS）法同時检测延丹胶囊中10种主要成分含量，建立延丹胶囊多组分定量与化学计量学的综合分析方法，构建延丹胶囊质量评控体系。方法 采用Hedera ODS-2（C18）色谱柱，乙腈-0.1%冰醋酸为流动相，梯度洗脱，检测波长230 nm（检测3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇和3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇）和280 nm（检测二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱）；选取丹参酮ⅡA为内参比物质，建立其与其他9种成分的相对校正因子，计算各成分含量，同时运用外标法验证所建立HPLC-QAMS法的重复性、合理性和可行性；运用化学计量学方法对10批样品的10种成分含量数据进行分析，挖掘对其质量控制具有显著贡献的主要成分。结果 定量分析的10种成分线性关系良好（r>0.999）；平均加样回收率96.93%～100.14%（RSD<2.0%）；HPLC-QAMS法所测结果与外标法无显著性差异；偏最小二乘-判别分析结果显示丹参酮ⅡA、3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇、丹参酮Ⅰ和延胡索乙素是影响延丹胶囊产品质量的差异性标志物（VIP值＞1）。结论 所建立的HPLC-QAMS多指标成分定量控制方法操作便捷，重复性与稳定性良好，结果准确可靠，结合化学计量学分析，可用于延丹胶囊的整体质量控制和综合评价。

〔关键词〕 延丹胶囊；多指标成分；高效液相色谱一测多评法；相对校正因子；化学计量学；质量评价

〔中图分类号〕R284.1       〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.014

Quality evaluation of Yandan Capsule by multi-component content determination using

HPLC-QAMS and chemometrics

HUA Yang XIE Fei ZHOU Hong LI Zhiming

1. Department of Pharmacy， The People's Hospital of Hai'an， Hai'an， Jiangsu 226600， China; 2. College of Pharmacy，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing， Jiangsu 210023， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To determine the content of 10 main components in Yandan Capsule （YDC） by high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker （HPLC-QAMS） method simultaneously and to establish a comprehensive analysis method for multi-component quantification and chemometrics of YDC so as to construct a quality evaluation and control system for YDC. Methods The gradient elution was performed on a Hedera ODS-2 （C18） column with acetonitrile-0.1% glacial acetic acid as the mobile phase. The detection wavelengths were set at 230 nm for 3， 29-dibenzoyloxykarounidiol and 3， 29-dibenzoyl rarounitriol， and 280 nm for dihydrotanshinone Ⅰ， cryptotanshinone， tanshinone Ⅰ， tanshinone ⅡA， protopine， tetrahydropalmatine， corydaline and tetrahydroberberine. Tanshinone ⅡA was selected as the internal reference substance to establish the relative correction factors with the other 9 components， the content of each component was calculated and the repeatability， rationality and feasibility of the established HPLC-QAMS method were verified by external standard method （ESM）. The content data of 10 components in 10 batches of samples were analyzed by chemometrics， and the main components that contributed significantly to its quality control were explored. Results The 10 components by quantitative analysis had a good linear relationship （r>0.999）; the average recoveries of the 10 components were 96.93%～100.14% （RSD<2.0%）; there was no significant difference between the quantitative results of HPLC-QAMS and ESM; the results of partial least squares-discriminant analysis showed that tanshinone ⅡA， 3，29-dibenzoyl rarounitriol， tanshinone I and tetrahydropalmatine were the differential markers affecting the quality of YDC （VIP>1）. Conclusion With good repeatability and stability， the established HPLC-QAMS multi-index component quantitative control method is convenient to operate， and the results are accurate and reliable. Combined with chemometric analysis， it can be used for overall quality control and comprehensive evaluation of YDC.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Yandan Capsule; multi-index component; high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker; relative correction factors; chemometrics; quality evaluation

延丹胶囊由瓜蒌、丹参、醋延胡索、五灵脂、醋乳香、白芍、枳壳和柴胡组方而成，具有活血祛瘀、理气止痛的临床功效，主要用于气滞血瘀引起的胸痛、胸闷、心慌、憋气类冠心病劳累性心绞痛的治疗[1]。现代研究表明，延丹胶囊联合阿司匹林可有效降低冠心病患者氧化应激水平，调节血清胱抑素C和纤溶酶原激活物抑制物-1水平，促进心功能恢复[2]；通过改善抗氧化应激水平，减少心肌炎症，发挥抗凋亡作用，对异丙肾上腺素诱导SD大鼠心肌缺血模型具有显著的改善作用[3]。目前，延丹胶囊执行标准为国家食品药品监督管理局国家药品标准YBZ04452005-2009Z，質量标准和文献报道仅对该制剂1～3种成分进行了含量检测[4]，未对检测结果进行综合评价。中成药所含化学成分繁多，现有质控标准不能表征其整体质量的差异性。本实验选取延丹胶囊君药丹参成分二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA，臣药醋延胡索成分原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱，佐药瓜蒌成分3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇和3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇为指标性成分，同时以丹参酮ⅡA为内参比物质，采用高效液相色谱一测多评（high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single marker， HPLC-QAMS）法对以上10种成分同时进行含量测定，并结合化学计量学方法发现多种成分含量数据间潜在的关联性，挖掘影响质量差异的主要成分，为延丹胶囊的整体质量控制和综合评价提供数据支持。

1 材料

1.1  试药

对照品隐丹参酮、原阿片碱、丹参酮ⅡA和延胡索乙素（中国食品药品检定研究院，批号分别为110852-201807、110853-201805、110766-202022和110726-202020，含量均不低于99.0%）；对照品二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、紫堇碱和四氢小檗碱（成都普瑞法科技开发有限公司，批号分别为PRF9072403、PRF9091108、PRF10022126和PRF8050941，含量均不低于98.8%）；对照品3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇和3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇（武汉天植生物技术有限公司，批号分别为CFS201901、CFS202101，含量均为98.0%）；延丹胶囊（天长亿帆制药有限公司，规格：0.3 g/粒，批号：200902、201001、210105、210109、210201、210914、211203、211207、220203和220301，编号依次为S1～S10）；乙腈和冰醋酸为色谱纯级别，其余试剂为分析纯。

1.2  仪器

高效液相色谱仪（UltiMate 3000型，美国热电公司；Waters e2695型，Waters公司）；Hedera ODS-2（C18）柱、Thermo BDS C18柱和Durashell C18柱（规格均为：5 μm，250 mm×4.6 mm）；电子分析天平（Mettler Toledo公司，XSE205DU型）；高频数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，KH-700TDB型）。

2 方法与结果

2.1  混合对照品溶液的制备

取各对照品适量，用70%甲醇制成含3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇0.096 mg/mL、3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇0.322 mg/mL、二氢丹参酮Ⅰ0.258 mg/mL、隐丹参酮0.592 mg/mL、丹参酮Ⅰ0.714 mg/mL、丹参酮ⅡA 1.130 mg/mL、原阿片碱0.128 mg/mL、延胡索乙素0.450 mg/mL、紫堇碱0.376 mg/mL、四氢小檗碱0.292 mg/mL的混合对照品贮备液，再精密吸取贮备液1.0 mL，用同一溶剂稀释20倍制得混合对照品溶液。

2.2  供试品溶液的制备

取延丹胶囊内容物混匀，取适量，研细。精密称取上述粉末2.0 g，加70%甲醇20 mL，超声处理30 min，放冷，70%甲醇定容至25 mL，摇匀，过滤，即得延丹胶囊供试品溶液。取按质量标准中处方及制备流程制备的缺瓜蒌、缺丹参和缺醋延胡索的阴性供试品各适量，按上述方法制得阴性供试品溶液。

2.3  色谱条件及专属性试验

色谱柱Hedera ODS-2（C18），柱温30 ℃，进样量10 μL；检测波长分别为230 nm（0～17 min检测3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇和3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇）[5-7]、280 nm（17～60 min检测二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱）[8-18]；流动相乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B），流速1.0 mL/min，梯度洗脱：0～11 min，7.0% A；11～17 min，7.0% A→30.0% A；17～34 min，30.0% A→55.0% A；34～50 min，55.0% A→78.0% A；50～60 min，78.0% A→7.0% A。在上述色谱条件下进样混合对照品溶液及供试品溶液，记录色谱流出曲线（见图1）。曲线图显示基线平稳，混合对照品溶液与供试品溶液在相同保留时间处均有相应的色谱峰出现，分离度均≥1.5；阴性供试品对延丹胶囊供试品的检测未产生干扰。

2.4  方法学考察

2.4.1  线性关系考察  精密吸取混合对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分别用同一溶剂定容至20 mL，摇匀制得序号为1～6的混合对照品溶液，按“2.3”项色谱条件检测，以对照品质量浓度对峰面积进行线性回归，结果见表1。

2.4.2  精密度考察  取2.2项下供试品溶液（编号：S1）一份，按“2.3”项色谱条件连续进样6次，记录3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇、3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱色谱曲线，结果峰面积的RSD值依次为1.33%、1.06%、1.18%、0.98%、0.87%、0.57%、1.30%、1.09%、1.14%、1.22%（n=6），表明精密度良好。

2.4.3  稳定性考察  取延丹胶囊（编号：S1）供试品溶液一份，于制备后0、2、4、6、10、16、24 h进样，记录3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇、3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、原阿片堿、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱色谱曲线峰面积，结果峰面积的RSD值依次为1.34%、1.03%、1.16%、1.01%、0.84%、0.59%、1.29%、1.12%、1.11%、1.20%（n=7），表明延丹胶囊供试品溶液24 h内稳定。

2.4.4  重复性考察  取延丹胶囊（编号：S1）6份，每份2.0 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.3”项色谱条件下检测，用外标法计算3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇、3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱的含量，结果含量的RSD值依次为1.88%、1.66%、1.74%、1.38%、1.29%、1.21%、1.79%、1.52%、1.61%、1.68%（n=6），表明重复性良好。

2.4.5  加样回收率实验  取延丹胶囊（编号：S1）细粉9份，每份精密称定1.0 g，分别加入混合对照品溶液（含3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇0.052 mg/mL、3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇0.239 mg/mL、二氢丹参酮Ⅰ 0.187 mg/mL、隐丹参酮0.489 mg/mL、丹参酮Ⅰ0.607 mg/mL、丹参酮ⅡA 0.928 mg/mL、原阿片碱0.086 mg/mL、延胡索乙素0.357 mg/mL、紫堇碱0.302 mg/mL和四氢小檗碱0.216 mg/mL的溶液）0.8、1.0、1.2 mL（各3份），再按“2.2”项方法制得加样供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下检测，得各成分的平均加样回收率为96.93%、97.92%、98.52%、99.34%、99.08%、100.14%、97.48%、98.73%、98.04%、97.90%；RSD分别为1.44%、0.90%、1.28%、1.50%、1.22%、0.75%、1.34%、1.61%、1.17%、1.31%（n=9）。

2.5  HPLC-QAMS法

2.5.1  相对校正因子（fi/s）的计算  在一定线性范围内各成分的量与检测器的响应值成正比。试验取“2.4.1”项6个混合对照品溶液，在“2.3”项色谱条件下检测，记录色谱曲线。以丹参酮ⅡA为参照物（丹参酮ⅡA质稳易得且价廉），计算各成分校正因子（fi/s）：fi/s=fi/fs=（ρ_i/A_i）/（ρ_s/A_s）=（ρ_i×A_s）/（ρ_s×A_i）（式中f_i/s、ρ、A、i、s依次代表相对校正因子、质量浓度、峰面积、参照物和其他待测成分）。详见表2。

2.5.2  色谱峰定位  采用相对保留时间值法对待测成分色谱峰进行定位，结果（见表3）测得RRT的RSD在0.81%～1.72%之间（n=6），表明采用相对保留时间值法可以对目标化合物色谱峰进行准确定位。

2.6  外标法与HPLC-QAMS法含量测定结果

取10批延丹胶囊（S1～S10）供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下检测，分别运用ESM和HPLC-QAMS法计算延丹胶囊中3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇等10种成分的含量（见表4）。再运用SPSS 26.0统计软件对每一成分的两组数据进行t检验，结果两种方法无显著性差异（P＞0.05），表明HPLC-QAMS法用于延丹胶囊中3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇等10种成分的含量测定是可行的。

3 延丹胶囊的化学计量学质量分析

3.1  聚类分析（cluster analysis， CA）

将10批延丹胶囊中3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇等10个成分一测多评法测定结果导入SPSS 26.0统计软件，通过组间连接聚类法，以欧氏距离为度量标准进行CA，得聚类树状图。从图2看出当判别条件距离为15时，10批延丹胶囊样品被分为三大类，一类包括S7、S8和S6，二类包括S2、S5、S3、S4和S1，三类包括S9、S10。

3.2  主成分分析（principal component analysis， PCA）

将10批延丹胶囊中3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇等10个成分一测多评法的测定结果导入SPSS 26.0统计软件进行PCA，得表5—6。以特征值大于1为提取标准，10批延丹胶囊有2个主成分，其特征值分别为6.171和2.931，对方差的贡献率分别为61.708%和29.307%，累计贡献率为91.015%，表明前2个主成分可反映样品的整体信息。表6显示二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA、原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱、四氢小檗碱等成分的综合为第一主成分的信息，第二主成分解释了3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇、3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇、丹参酮Ⅰ的信息。再运用SIMCA 14.1统计软件对10批延丹胶囊中3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇等10个成分建立PCA模型（见图3），共提取出2个主成分R2X为0.910，大于0.5，所建立的模型稳定性较高。图3显示S1～S5、S6～S8以及S9～S10分别呈现一定相关性，与CA结果一致。

3.3  偏最小二乘法-判别分析（partial least squares discrimination analysis， PLS-DA）

将10批延丹胶囊中10个成分一测多评法测定的结果导入SIMCA 14.1统计软件进行PLS-DA，结果得到PLS-DA（R2X＝0.927、Q2＝0.727）模型，筛选出4个色谱峰的变量重要性投影（variable importance for projection， VIP）值大于1，即成分6（丹参酮ⅡA，VIP=1.664）、成分2（3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇，VIP=1.469）、成分5（丹参酮Ⅰ，VIP=1.160）和成分8（延胡索乙素，VIP=1.009）对延丹胶囊样品质量的影响较大，可能是影响延丹胶囊产品质量的主要潜在标志物（VIP>1）。

4 讨论

4.1  指标性成分的选择

延丹胶囊由丹参、延胡索（醋制）、五灵脂、瓜蒌、乳香（醋制）、白芍、枳壳、柴胡配方而成。方中丹参活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈，为君药，其主要活性成分以二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA为代表；醋延胡索、五灵脂和醋乳香助丹参行气活血止痛，共为臣药；白芍、枳壳、柴胡、瓜蒌具有疏肝解郁、理气宽胸之效，共为佐使药。诸药合用有活血化瘀、理气止痛的作用。根据中药质量标志物选取原则，本实验选取君药丹参代表性成分二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA，臣药醋延胡索主要成分原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱，佐药瓜蒌代表性成分3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇和3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇为定量控制指标成分，采用HPLC-QAMS法对上述成分含量同时进行检测。同时选取含量较高，出峰时间较居中，且质量较为稳定的丹参酮ⅡA为内参比物质。

4.2  供试品溶液制备方法的确定

本试验在筛选供试品溶液制备方法时，通过对提取溶媒的种类、提取方法和提取时间3个因素进行考察，结果发现70%甲醇超声提取30 min时，3，29-二苯甲酰基栝楼仁二醇等10种成分的提取率最高，杂质干扰最少。

4.3  HPLC-QAMS法与化学计量学结果评价

HPLC-QAMS法测定延丹胶囊中10种成分含量，通过与外标法比较，结果显示两种方法差异性较小（P＞0.05），表明HPLC-QAMS法是可行的，为该制剂多指标成分质控方法的普及应用提供了有利支持；CA和PCA的结果表明10批延丹胶囊聚为3类。PLS-DA分析的分析结果显示丹参酮ⅡA、3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇、丹参酮Ⅰ和延胡索乙素等成分可能是影响延丹胶囊产品质量的主要潜在标志物。中药复方制剂一般由多味中药材组方而成，所含成分复杂，同一原药材即使符合同一药品标准，但其地域、气候不同可能造成所含成分差异较大，导致使用该药材生产的制剂质量差异也较大，从而产生不同的治疗作用。

本试验采用HPLC-QAMS法建立了延丹胶囊10种指标成分定量质控模式，对市场流通的10批不同阶段生产的样品进行检测，同时联合化学计量学识别模式进行综合分析，发掘出了影响产品质量差异性的主要物质性成分，为提高延丹胶囊质控水平及整体质量，确保产品质量稳定和临床治疗效果的一致性提供了实验基础。

参考文献

[1] 国家食品药品监督管理总局.国家药品标准YBZ04452005-2009Z[S]. 2009-09-12.

[2] 李文英， 吕  培. 延丹胶囊联合阿司匹林对冠心病病人氧化应激反应指标及血清CysC、PAI-1水平的影响[J]. 中西医结合心脑血管病杂志， 2021， 19（9）： 1535-1539.

[3] 焦  杰， 马星月， 傅  强， 等. 延丹胶囊对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血的作用及机制[J]. 中成药， 2021， 43（4）： 908-913.

[4] 王玉龙， 袁步娟， 赵海欣， 等. HPLC法测定延丹胶囊中原儿茶醛、芍药苷和橙皮苷的含量[J]. 解放军医药杂志， 2015， 27（12）： 104-108.

[5] 孙洋洋， 楚冬海， 乔  微， 等. 瓜蒌子专属性成分的含量测定及其指纹图谱的研究[J]. 中华中医药学刊， 2019， 37（5）： 1155-1159.

[6] 魏国栋， 马思缇， 王苏丽. 瓜蒌皮药材质量标准研究[J]. 亚太传统医药， 2015， 11（13）： 29-31.

[7] 谭  翔， 邹  顺， 薛  琰， 等. 黔产瓜蒌中3， 29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的含量测定[J]. 贵阳中医学院学报， 2014， 36（3）： 14-15.

[8] 李占芳， 李俊卿， 许  伟， 等. HPLC一测多评法测定乳宁颗粒中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、王不留行环肽A和王不留行环肽B[J]. 药物评价研究， 2021， 44（7）： 1434-1440.

[9] 何  艳， 胡小祥， 陈新明， 等. 高效液相色谱法同时测定丹膝颗粒中8种成分的含量[J]. 中药新药与临床药理， 2021， 32（2）： 263-267.

[10] 管小军， 厉  君， 黄娜娜， 等. HPLC同时测定紫丹参药材中8种成分含量[J]. 中国中医药信息杂志， 2020， 27（9）： 82-86.

[11] 舒  翔， 王晓仙， 黄文涛， 等. HPLC-QAMS法同时测定灵丹片中9种成分含量[J]. 湖北中医药大学学报， 2022， 24（4）： 43-48.

[12] 彭  洋， 徐忠诚， 周  涛， 等. HPLC法同时测定柔肝顺气丸中7种成分的含量[J]. 中国药师， 2019， 22（10）： 1957-1960.

[13] 王艷伟， 代雪平， 王晓伟. HPLC法测定益心通脉颗粒中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量[J]. 西北药学杂志， 2018， 33（4）： 471-474.

[14] 毕福钧， 林  彤. RP-HPLC法同时测定醋延胡索配方颗粒中7种生物碱[J]. 中草药， 2016， 47（4）： 606-609.

[15] 田  甜， 陈镜楼， 黄徐英， 等. 高效液相色谱一测多评法同时测定木丹颗粒中9种成分[J]. 医药导报， 2022， 41（3）： 388-395.

[16] 罗  镭， 李文庭， 谭春梅， 等. HPLC同时测定延胡索中4个化学成分的含量[J]. 江西中医药， 2017， 48（9）： 64-66.

[17] 张  丹， 王昌利， 卜雕雕， 等. 高效液相色谱法同时测定延胡索中5种生物碱含量的方法学研究[J]. 中南药学， 2018， 16（12）： 1759-1762.

[18] 郭宝凤， 周雪梅. 反相高效液相色谱法测定蒙药材灰绿黄堇中原阿片碱含量[J]. 中国药业， 2020， 29（19）： 69-72.