牛呼吸道疾病病原采样方法概述

庞 敏,张力本,坤清芳,肖 霞,董彦强

阿坝职业学院,四川 茂县 623200

0 引言

牛呼吸道疾病(bovine respiratory disease,BRD),又称牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex,BRDC),是牛场中最常见的一类疫病,主要由细菌、支原体、病毒单独或混合感染引起的牛肺炎、支气管炎等疾病的统称[1]。全球约有46%的犊牛患有BRD,患病奶牛的产奶量、公牛的繁殖力、育肥牛的增重以及牛的免疫能力均会降低,严重影响了养牛业的健康发展[2]。与该病发生常见的病原有:睡眠嗜组织菌(Histophilussomni,Hs)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica,Mh)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,Pm)、牛支原体(Mycoplasmabovis,Mb)、牛呼吸道合胞病毒(bovinerespiratorysyncytialvirus,BRSV)、牛冠状病毒(bovinecoronavirus,BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus,BVDV)、牛α疱疹病毒1型(bovinealphaherpesvirus1,BoHV1)、牛副流感病毒3型(bovineparainfluenzavirus3,BPIV-3)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectiousbovinerhinotracheitisvirus,IBRV)[3]。此外,也与饲养管理水平和环境因素有关[4]。导致BRD流行的诱因包括:长途运输、合群饲养前没有时间适应新环境、未注射疫苗、营养、温度等不利条件均可能导致免疫抑制进而增加牛对呼吸系统病原体的敏感度。这些病原体可单一感染或在混合感染中协同作用,使疾病更加严重[5]。实验室诊断结果的精准性依赖于正确的采样,一次性有效的采样,不仅可以准确检测BRD病原,也可以减少重复采样带来的应激反应。

1 采样动物的选择

在疾病发生的前期,无抗菌素治疗史,也没有表现出明显的呼吸道症状的动物是首选。在疾病的急性期取样,检测到病毒成分的几率更高。此外,应避免对严重呼吸窘迫的动物取样,可以降低疾病加重和死亡的风险。需要注意的是样本量应适宜,采样的动物应具有群体代表性,使检测结果能代表群体发病。

2 牛呼吸道疾病病原采样方法

2.1 鼻拭子采样

鼻拭子采样(nasal swabs,NS),主要取样自鼻黏膜,保定动物头部,用一次性纸巾把牛的鼻孔擦干净,将20 cm长的棉签插入鼻腔约10 cm处,拭子在鼻黏膜上旋转以收集鼻分泌物样本。在插入和取出棉签时,需要防止棉签被鼻孔上的灰尘等污染。除长棉签外,还可采用刷子拭子,刷子拭子会采集更密集的黏膜,可能具有更高的检出率,但刷子拭子易损伤黏膜,采集的样本可能会被血液污染。

2.2 深部鼻咽拭子

深部鼻咽拭子(deep nasopharyngeal swabs,DNSs)取样自鼻咽的呼吸道和相关淋巴上皮,用一次性纸巾把牛的鼻孔擦干净,将59 cm的棉签插入鼻腔约50 cm处进行取样,如图1(a)所示[6]。然而,DNSs的最大问题是采集了大量的多微生物样本,导致其他无关病原影响BRD的诊断,从而严重影响临床解释结果。

图1 牛呼吸道取样方法

2.3 防护套鼻咽拭子

防护套鼻咽拭子(guarded nasopharyngeal swab,NPS)在操作时,动物站立保定,用一次性纸巾将牛的鼻孔擦干净,然后将59 cm的带聚酯防护套的棉签由鼻腔推进,直到剩下的长度至眼内眦头端约2 cm的位置。取样时,棉拭子向前推进约4 cm,在鼻咽部旋转,取样完成后将棉签收回聚酯防护套内,再取出。NPS与DNSs相比,采集的样本免受鼻腔微生物的污染。

2.4 经气管冲洗或经气管抽吸

为了克服鼻拭子采样污染的问题,经气管冲洗或经气管抽吸技术(transtracheal wash or transtracheal aspirate,TTW/TTA)被应用。保定牛只,对操作部位皮肤进行消毒后,通过采样针或导管进行气管穿孔,如图1(b)所示。经气管抽吸呼吸道的黏液,或采用生理盐水液体灌注、经气管冲洗呼吸道进行采样。由于支气管分支是整个肺的黏液纤毛系统流出汇合的地方,因此,TTW、TTA取样对整个肺具有代表性。

2.5 内窥镜支气管肺泡灌洗和非内窥镜支气管肺泡灌洗

在内窥镜支气管肺泡灌洗(endoscopic bronchoalveolar lavage,BAL)操作中,将1根BAL导管或柔性内窥镜通过鼻子和气管进入下气道,直到其进入较大(或较小,取决于导管直径)的支气管。然后注射一定量(犊牛通常为60 mL)的无菌生理盐水,并立即抽吸。如有必要,可进行第2次或第3次注射抽吸。但是该方法成本较高,且耗时较长,因此不适合小型养殖场和多动物采样。

非内窥镜支气管肺泡灌洗技术(nonendoscopic bronchoalveolar lavage,nBAL)可以解决内镜下BAL成本高的问题。在nBAL操作中,将犊牛头部进行固定,鼻子尽可能朝上,以便于将导管引入气管,或者将牛的头部置于水平位置,并在吸气时通过鼻、咽喉和气管引入BAL导管,到达大支气管的楔形位置,并注射一定量(30～250 mL)的无菌生理盐水,轻轻地抽吸,如图1(c)所示。在80%的动物中,nBAL取样可以在几分钟内完成[6]。

2.6 病死牛肺脏组织

病死牛肺脏组织取样自BRD病死牛剖检后肺脏病变部位,由于肺脏组织是在牛死亡后剖检才能检测,所以对于预防性检测病原体意义不大。

2.7 血清样本

血清样本采自尾静脉穿刺采集全血,然后收集血清进行检测。

2.8 其他采样方法

其他采样方法包括采集患有呼吸道症状的牛的鼻液、眼分泌物、气管病变部位、采集脾脏等实质器官或出现相应临床症状的排泄物、阴道分泌物、牛乳等。

3 不同采样方法优缺点

NS主要取样自鼻黏膜,操作方便快捷,对操作人员技术要求低,对牛只刺激反应小或几乎无不良反应。但采样结果易受鼻腔共生微生物的影响,且只能对上呼吸道取样。DNSs取样自鼻咽的呼吸道和相关淋巴上皮,从鼻腔伸入取样时易被鼻腔微生物污染,可通过擦拭鼻孔(用一次性纸巾或含酒精的纱布)或使用带聚酯防护套的NPS来减少污染。虽然DNSs和NPS不直接采集下呼吸道样本,但对于大多数病原体,DNSs和NPS结果与TTW或BAL结果之间存在关联性[7]。此外,DNSs和NPS对牛只的并发症较少,包括鼻出血和棉签轴断裂,若棉签轴断裂,动物可以通过打喷嚏或吞咽将断裂的棉签进行排出。BAL或nBAL可获得具有代表性的下呼吸道样本,但采集的样本也可能包含上呼吸道共生细菌。此外,由于BAL仅对楔形管远端的支气管肺泡单位进行采样,因此有可能漏掉在整个肺中分布不均匀的病原体。BAL或nBAL对操作人员技术要求高,BAL需要专门的仪器,价格昂贵,不适合小型养殖场。nBAL采样大约需要耗时10 min/只,对于样本数较大时,花费时间成本高。且采样过程中可能发生鼻出血、肺内出血、气道穿孔、灌洗液引起的呼吸窘迫等并发症。TTW或TTA允许在绕过鼻咽正常菌群的情况下从下呼吸道采集样本,虽然克服了鼻咽的污染,但该过程是侵入性的且耗时较长10 min/只,对操作人员技术要求高,且易发生皮下气肿、穿刺孔感染、局部出血、穿刺导管断裂在气管内以及灌洗液抽吸不全所引起的呼吸困难等并发症。牛肺脏组织采样自病死牛剖检后肺脏病变部位,但需要在牛只死亡后才能采样检测,对BRD的预防意义不大。血液样本采自牛只静脉血,操作简单,但对已接种疫苗的动物或某些携带母源抗体的犊牛来说,存在假阳性的情况,使检测结果难以解释。相比之下,NS更容易收集且操作方便,节省人力物力资源。通过一次性纸巾擦拭鼻腔可降低微生物污染。采样部分优缺点对比如表1所示。

表1 牛呼吸道疾病不同采样部位概述及优缺点

4 结束语

任何诊断工作的真正意义在于将检测结果从采样动物外推到整个群体,有助于确定病因,尽早给出预防和治疗策略,降低BRD导致的经济损失。快速准确地诊断出导致BRD发生的病原依赖于正确的采样部位。