运动抑制3-羟甲基戊二酰-CoA合成酶2表达减轻阿霉素所致小鼠心肌病的作用

陈海丽，沈康敏，陈跃伟，王莉，陆俊宏，李盛村，屠文展

1.温州医科大学附属第二医院 康复医学中心，浙江 温州 325027；2.浙江省针灸康复重点实验室温州市康复重点实验室，浙江 温州 325027

阿霉素是最常见的化疗药之一，但其心脏毒性限制了阿霉素在癌症化疗中的应用。研究表明，没有原发性心肌病时阿霉素可诱导急性心肌病模型，模型小鼠表现为体质量减轻，心脏重量减小，心肌损伤标志物增加[1]。阿霉素也可诱导慢性心脏毒性动物模型，模型小鼠心脏出现炎症、氧化应激和心肌细胞凋亡[2]。此外，阿霉素可引起小鼠心脏内皮细胞破坏，内皮损伤标志物增加[3]。

合理运动是心脏康复的重要手段，也有提高免疫力和清除癌症细胞的能力。耐力运动（尤其是高强度重复次数）可以促进骨骼肌、心肌生理性适应，心肌和骨骼肌增厚，这种运动“预处理”方式，可以抵抗阿霉素造成的肌肉萎缩表型[4]。除了耐力运动，抗阻运动（每组10次，每次3组，每周3次，持续8周）也可以改善阿霉素所致慢性心肌病舒张动脉压、心率、交感神经张力和氧化应激[5]。此外，低中强度的有氧运动减轻了阿霉素引起的心肌萎缩，恢复了心肌细胞横截面积[6]。然而，运动改善阿霉素心肌病的分子机制仍不完全清楚。

尽管3- 羟甲基戊二酰-C o A 合成酶2（3-hydroxymethyl glutaryl-CoA synthase 2,HMGCS2）是酮体合成的限速酶[7]，且补充酮体可能对心衰患者有益[8]。但在其他心肌病研究中发现，运动抑制HMGCS2能改善脂毒性心肌病[9]；类似的，在非酒精性脂肪肝中，抑制HMGCS2也能够减少肝纤维化和肝脏脂肪沉积等病理改变[10]。截至目前，仍鲜有研究揭示HMGCS2在阿霉素引起的心肌病中的作用。本研究探讨运动调控HMGCS2在预防阿霉素所致的心功能降低过程中的作用，以期为寻找治疗阿霉素心肌病的新靶点提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物：6～8周龄雄性C57BL/6小鼠购自浙江维通利华实验动物技术有限公司[动物许可证号：SCXK（浙）2019-0001]，饲养于温州医科大学实验动物中心SPF级动物实验室。饲养标准条件：恒温20～22 ℃，每天接受12 h光照。小鼠自由进食饮水。

1.1.2 试剂与仪器：阿霉素购自北京索莱宝生物试剂有限公司。Vevo2100小动物超声成像仪购自加拿大Visualsonics公司。TRIzol、反转录试剂盒及定量PCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。HMGCS2一抗购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及干预造模：小鼠随机分为静养对照组（Con组）、阿霉素组（Dox组）、运动+阿霉素组（Exe组），每组6只。Con组静养，Dox组采用腹腔注射20 mg/kg阿霉素，Exe组在腹腔注射阿霉素之前进行30 d游泳运动。Exe组运动安排如下：在方形塑料框（60 cm×50 cm×40 cm）中装30 ℃温水，将小鼠置于塑料框中开展游泳运动。第1 周进行适应性训练，水位高度7 cm，从第2周开始游泳时间从10 min逐渐增加至40 min，水位高度15 cm，迫使小鼠保持40 min游泳，正式游泳时间30 d。30 d游泳结束4 h后，注射阿霉素制造心肌损伤模型。

1.2.2 小鼠心脏功能评价及心脏组织取材：阿霉素注射后第4天，将其用异氟烷麻醉并脱毛，超声探头获取心尖四腔位，M模式下获取心脏超声影像，并计算心脏射血分数（ejection fraction, EF），短轴缩短率（fractional shortening, FS），和E/A比值。阿霉素注射后第5 天，采用水合氯醛麻醉后，打开小鼠胸腔，剪取心脏，迅速挤压出心腔内血液，并剪去心底部血管，冷冻。

1.2.3 心肌细胞横截面积评估：组织用4%多聚甲醛固定，自动脱水机脱水，包埋，切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化，用WGA荧光染料染色1 h，含DAPI的防荧光猝灭封片剂封片。在奥林巴斯荧光显微镜下，摄取图片，用ImageJ软件进行数据统计。

1.2.4 心脏组织mRNA表达检测：用TRIzol等提取和分离总RNA，分光光度计测定RNA浓度，评定RNA纯度，利用试剂盒进行反转录，最后对样本cDNA进行PCR定量。使用的引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.2.5 心脏组织蛋白表达检测：用适量裂解液、磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂等裂解组织，剪刀剪碎组织后匀浆，BCA法测定蛋白浓度，配好蛋白体系后，利用SDS-PAGE凝胶电泳法使蛋白分离，再用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，封闭，总caspase-3（T-caspase-3，1:1 000，美国Proteintech公司），激活的caspase-3（C-caspase-3，1:1 000，美国Proteintech公司），HMGCS2（1:1 000，美国Santa Cruz公司）和GAPDH（1:5 000，美国Proteintech公司）一抗过夜，二抗孵育等步骤后，在化学发光凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）中利用超敏ECL化学发光液（苏州新赛美生物科技有限公司）使蛋白显影。

1.2.6 HL-1细胞培养及HMGCS2抑制：HL-1细胞由上海冠导生物工程有限公司提供，使用DMEM完全培养基（含10% FBS、100 U/mL青霉素和10 U/mL链霉素）进行细胞培养（37 ℃，5% CO2）。细胞贴壁至80%左右，用0.02%姨酶消化细胞，接种于24孔板，进行细胞正式实验。在培养的细胞中加入50 nmol/L HMGCS2 siRNA（上海吉玛制药技术有限公司），处理24 h后，加入阿霉素（2 μmol/L），干预16 h，并进行细胞活力和细胞凋亡相关指标测试。

1.2.7 CCK8检测细胞活力：细胞活力按照上海碧云天公司的CCK8试剂盒说明书检测，试剂加入15 min后，以450 nm波长检测吸光度值。

1.3 统计学处理方法 使用GraphPad Prism v5.0软件统计分析。计量资料采用±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 运动预防阿霉素所致小鼠心脏功能紊乱 与Con组比，Dox组小鼠心脏功能降低（P＜0.05）。与Dox组小鼠相比，运动可减轻阿霉素引起的心脏收缩和舒张功能的损害（P＜0.05）。见图1。

图1 运动对阿霉素心肌病小鼠心脏功能的影响

2.2 运动改善阿霉素所致小鼠心肌萎缩 与Con组比，Dox组小鼠平均心肌细胞横截面积明显减少（P＜0.05），2 个萎缩的基因标志物Atrogin-1 及MuRF-1的mRNA相对表达量明显升高（P＜0.05）。与Dox组小鼠相比，运动干预可显著改善阿霉素导致的上述心肌萎缩指标（P＜0.05）。见图2。

图2 运动改善阿霉素心肌病小鼠心肌萎缩

2.3 运动减少阿霉素诱导心肌病中HMGCS2的表达与Con组比，Dox组小鼠心脏中HMGCS2 mRNA和蛋白表达量均显著升高（P＜0.05）。与Dox组小鼠相比，Exe组HMGCS2 mRNA和蛋白表达降低（P＜0.05）。见图3。

图3 运动对阿霉素心肌病小鼠心脏HMGCS2 mRNA和蛋白表达的影响

2.4 抑制HMGCS2增加阿霉素处理的心肌细胞生存细胞实验结果表明，阿霉素引起HL-1心肌细胞细胞活力降低（P＜0.05），细胞中HMGCS2表达增加、C-caspase-3/T-caspase-3比值增加（P＜0.05），而采用siRNA抑制HMGCS2表达后，可以提高心肌细胞活力（P＜0.05），C-caspase-3/T-caspase-3比值降低（P＜0.05）。见图4。

图4 抑制HMGCS2对阿霉素引起的心肌细胞活力和凋亡的的影响

3 讨论

近年来，由于各类创新方法的研究，阿霉素的应用得到进一步维持和拓展。ZHOU等[11]发现将阿霉素结合CD133（肝癌干细胞样细胞标志物）形成适体，靶向治疗肝癌细胞，可以减少对其他细胞的伤害。负载阿霉素的胶束低分子量肝素-虾青素纳米颗粒，通过抑制中性粒细胞胞外陷阱（neutrophicle extracellular traps, NETs）的形成，能够关闭炎症前馈环和网状结构的形成，抑制肝转移，抑制肺转移，缓解肿瘤的炎症和免疫抑制微环境，为乳腺癌及其肝、肺转移提供了一种有希望的治疗策略[12]。此外，功能纳米颗粒还可以负载阿霉素与IL-2和干扰素-γ，利用增强免疫应答的方法，促进阿霉素抗肿瘤作用[13]。同样，阿霉素联合miR-34a[14]和STAT3 siRNA[15]均能增强阿霉素的抗肿瘤效益。因此，阿霉素的应用得到进一步延续和拓展，其对机体的不良反应机制仍值得进一步研究。

长期使用阿霉素抗肿瘤导致心脏、肾脏等不良反应，是限制阿霉素的主要因素。研究证实，即使没有原发性心脏病，阿霉素作为化疗药物使用也会导致心功能不全[16]。在阿霉素急性小鼠模型中，降低炎症应答（例如IL-22敲除）有助于缓解心脏毒性，降低了血清和左心室组织中心肌损伤标志物的表达，并改善心功能[17]。此外，减少氧化应激也能降低阿霉素引起的心肌损伤[18]，例如小鼠NADPH氧化酶2缺陷，减少了超氧化物产生，可以消除阿霉素相关急性心脏损伤[19]。

除了传统生理机制研究外，在动物实验中，基因干预手段也被用于阿霉素相关心肌病研究领域。采用腺相关病毒实现心脏特异的miR-204过表达，可以抵抗注射阿霉素（15 mg/kg）导致的心肌损伤[18]。同样，过表达miR-146a通过靶向TAF9b/P53途径减少阿霉素引起的心肌凋亡，部分逆转了阿霉素诱导的心脏毒性[20]。本研究结果与上述结果一致，中高剂量的阿霉素引起急性心脏功能降低。

药理学方法和基因疗法在临床转化方面，仍需要较长时间的安全性检验。运动作为无创而安全的非药理学治疗方式，可以增强免疫功能，又能够直接减缓各类心肌病的发生和发展[21-22]。本研究结果表明，运动干预减少了阿霉素所致心肌萎缩的发生，可能是改善心脏功能的重要机制。本研究结果提示，阿霉素化疗之前，给予一定的运动康复方案，可能有助于减轻阿霉素引起的心血管不良事件，也可能更有利于癌症患者整体康复。

然而，短期的运动并不能达到这些良好的护心效益，并且部分患者无法运动和不愿意运动。因此，研究运动保护阿霉素心肌病的机制尤为重要。运动产生的活性物质，可以模拟运动效益，为阿霉素相关的心肌病药物研发提供实验支持。在机制上，本研究还初步确定了运动可能通过抑制HMGCS2而发挥阻止阿霉素心肌病的作用。在本课题组之前的研究中也发现，HMGCS2在脂毒性心肌病小鼠心脏中表达增加，抑制HMGCS2后可以减少高浓度棕榈酸引起的心肌细胞凋亡[9]。类似的，在非酒精性脂肪肝小鼠肝脏中，运动也可以减少HMGCS2的表达[10]，在肝细胞中抑制HMGCS2也能够降低棕榈酸引起的细胞凋亡[23]。在阿霉素引起的心肌萎缩和心功能降低过程中HMGCS2的作用仍未见报道。本研究结果表明，在阿霉素所致心肌萎缩过程中，增加的HMGCS2可能促进β羟基丁酸等酮体中介产物形成，进一步损害阿霉素心肌组织中心肌细胞代谢[24]。运动通过减少HMGCS2的表达而减少心肌细胞凋亡，最终有利于心脏功能保存。然而，HMGCS2保护阿霉素引起的心肌萎缩的分子作用仍需进一步实验研究。

总之，在阿霉素所致心肌病小鼠中，运动通过抑制HMGCS2减少心肌细胞凋亡，从而改善心肌萎缩和心脏功能。