基于网络药理学探究补阳还五汤的治疗潜能及作用机制

雷欢，陈雪琴，胡锦玉，吴奇芝，段燕林，方海红

江西科技师范大学，江西 南昌 330013

补阳还五汤是活血化瘀疗法的代表性配方，最早由清代医生王清任在当归补血汤的基础上创制。补阳还五汤具有益气、活血通络功效［1］。广泛用于缺血性脑血管病、冠心病、心肌梗死和其他血栓栓塞疾病的预防和治疗。补阳还五汤由七种中药组成：黄芪、当归、赤芍、川芎、桃仁、红花和地龙。鉴于我国拥有的丰富草药资源，有必要对其进行深入研究并加以合理地开发与利用，为补阳还五汤的应用创造更多的价值［2］。

随着信息时代的发展，网络药理学已经成为药物机制研究和药物开发的新途径，包括探索药物对疾病的基本药理作用及其机制，分析中医理论，以及研究中医药的应用［3］。目前，基于网络药理学对补阳还五汤治疗某一疾病作用的探讨已有作者提出，如对心衰、心绞痛、动脉粥样硬化等心血管疾病的研究［4-5］，以及糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病的研究等［6-7］。补阳还五汤的多靶点、多通路特点，有治疗多种疾病的优势，但未见文献对其治疗不同疾病潜能进行报道。基于此，本研究通过可视化技术将补阳还五汤生物网络中“药物-靶点-基因-疾病”间的大量信息及他们之间的相互作用的复杂联系转化为直观的可视网络，通过网络关系预测或揭示药物对机体的作用机制，以期为补阳还五汤的临床应用与开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 补阳还五汤生物活性成分和靶标的鉴定

补阳还五汤的中药生物活性成分从药理学数据库和分析平台（TCMSP,http://ibts.hkbu.eAdu.hk/LSP/tcmsp.php），中医百科全书（ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/）和文献中获得。根据ADME 的原则，设置OB ≥30%和BL ≥0.18 为阈值，获得补阳还五汤的主要活性成分，并从上述数据库获得各成分的靶基因，通过UniPort 数据库对所有靶基因进行了标准化。

1.2 构建PPI 网络筛选关键靶点

将补阳还五汤靶点基因导入STRING 数据库(http://string-db.org) 进行蛋白分析，得到蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，以置信度≥0.9 为筛查标准，将筛选后靶点信息导入 Cytoscape 3.9.0 绘制并构建PPI网络图，利用Network Analyzer 和CytoNCA 插件，根据连接度、介度、紧密度等参数分析并获取网络核心靶点。

1.3 GO 和KEGG 富集分析

将核心靶点导入DAVID 数据库(https://david.Ncifcrf.gov/)进行GO 功能注释和KEGG 通路富集分析。确定主要的生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）和关键信号通路，并绘制GO 分析和KEGG 通路富集图。

1.4 补阳还五汤治疗疾病潜能预测

将富集的关键信号通路导入CTD 数据库（http://ctdbase.org/），通过“Batch Query”查询并下载各通路相关联的疾病。将所有通路对应的疾病以及出现频次较多的疾病进行统计分析。

1.5 构建“成分-靶点-通路-疾病”网络

为直观呈现补阳还五汤对治疗疾病的作用机制，将筛选的补阳还五汤活性成分、对应的靶点、主要通路及对应的疾病导入Cytoscape 3.9.0 绘制可视化网络图。

2 结果

2.1 补阳还五汤生物活性成分和靶标的收集

从TCMSP、ETCM 数据库和PubMed 文献中获得补阳还五汤的生物活性成分92 个，包括黄芪活性成分19 个、当归成分7 个、赤芍成分14 个、川芎成分11 个、桃仁成分19 个、红花成分16 个和地龙成分6 个。去除重复后获得80 个补阳还五汤的活性化合物以及566 个相应靶基因。

2.2 PPI 网络构建以及筛选关键靶点

将补阳还五汤筛选的566 个靶基因导入STRING 平台构建PPI 网络，并利用Cytoscape3.9.0进行可视化，获得459 个节点，2 523 条边的网络。构建PPI 网络如图1 所示。

图1 补阳还五汤核心靶点的PPI网络图

2.3 GO 功能和KEGG 途径富集分析

通过David 数据库对459 个关键靶基因进行了富集和分析，共获得1 444 个富集项目，包括237个MF，1 060 个BP 和147 个CC 类别，根据count值构建了前10 项的条形图（图2）。在BP 类别中，排名靠前的包括RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控，信号转导等；CC 组分排名靠前的包括细胞质、细胞核等；MF 过程排名靠前的有蛋白结合、酶结合等。KEGG 富集分析获得1 016 条信号通路。根据count 值绘制了20 条关键信号通路的气泡图（图3），主要包括信号转导、免疫系统、代谢作用等。

图2 补阳还五汤作用靶点GO富集分析图

图3 补阳还五汤作用靶点KEGG通路富集分析图

2.4 补阳还五汤治疗疾病潜能预测

将前20 条KEGG 通路导入CTD 数据库进行疾病分析，将所得到的疾病进行汇总，筛选出富集较为集中的为心脑血管疾病以及多种肿瘤，其中调控肝硬化、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、肝癌、胃肿瘤等肿瘤的基因富集显著。

2.5 “成分-靶点-通路-疾病”网络构建

用Cytoscape 3.9.0软件建立补阳还五汤“成分-靶点-通路-疾病”交互网络，见图4，清楚地展现补阳还五汤的活性成分、通路、靶点与不同疾病的作用关系，也揭示补阳还五汤的药效作用机制。

图4 补阳还五汤治疗多疾病的“成分-靶点-通路-疾病”交互网络

3 讨论

补阳还五汤是一个经典的中药方剂，广泛用于缓解神经功能障碍和改善气虚血瘀型冠心病［8］。本研究利用网络药理学探讨补阳还五汤的治疗潜能及作用机制，使用数据挖掘，从补阳还五汤的7 种中药中获得了92 个活性成分和556 个潜在目标。其中槲皮素、川芎嗪、藁本内酯、羟基红花黄色素A和二氢辣椒素等主要活性成分涉及的通路包括信号转导、免疫系统、代谢作用等信号通路，对心脑血管疾病及多种肿瘤具有较好的治疗潜能。

中医认为肝硬化后期辨证主要属气虚血瘀，补阳还五汤能补气活血、化瘀通络，正切合本病病机。有研究［9］表明它能改善微循环，对抗增生性炎症，还可降低血清谷丙转氨酶。乳腺肿瘤前期临床表现为乳房肿块、胀痛等，病机多为肝郁气滞之实证，常选用补阳还五汤加减［10］。槲皮素具有抑制肿瘤细胞生长并诱导其凋亡的作用，在抗肝癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌及膀胱癌中发挥的药理作用与使用剂量都已得到国内外的广泛认可，且大多都呈现剂量与时间的依赖性［11-12］。川芎嗪具有抑制白血病、乳腺癌、前列腺肿瘤等多种恶性肿瘤的作用［13-14］。羟基红花黄色素 A 是中药红花活血通经、散瘀止痛功效相关的有效成分之一，研究表明，羟基红花黄色素 A 除了抗心肌缺血作用外，还具有抗脑缺血，改善认知，抗帕金森病，降血糖，抗癌，改善肺、肝、肾及骨组织功能等多种药理作用［15］。

综上所述，本研究采用网络药理学方法对补阳还五汤作用的关键通路与治疗潜能进行了分析。补阳还五汤可能通过信号转导、免疫系统、代谢作用等信号通路，改善心脑血管疾病，同时对肝硬化、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、肝癌、胃肿瘤等疾病具有较好治疗潜能，为补阳还五汤治疗肿瘤等疾病提供了理论依据。