临夏不同产地款冬花有效成分与矿质元素含量的相关性研究

林春松，黄青云，张雪芹，赵克旺，刘鸿洲，徐夙侠*

（1.福建省亚热带植物研究所/福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门 361006；2.临夏州农业科学院，甘肃 临夏 731100）

款冬花是我国传统中药材，为菊科款冬属植物款冬(Tussilago farfara L.)的干燥花蕾，其味辛、微苦，性温，归肺经，具有润肺下气、止咳化痰的功效，传统上用于治疗新久咳嗽、喘咳多痰、劳嗽咯血等症［1］。研究表明，款冬花在抗肿瘤、抗氧化、抗菌、减肥、神经保护等多个方面具有良好的药理活性。款冬花的化学成分主要有萜类、黄酮类、酚酸类、甾醇类、生物碱［2］。据李玮等报道［3-4］，款冬花中含量较高且具有良好药理活性的有效成分是款冬酮、芦丁、绿原酸类（绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C）。

近年来，随着对中药研究的不断深入，作为构成植物体内基本组成成分的矿质元素也引起了众多学者的重视。植物吸收的矿质元素包括大量营养元素（氮、磷、钾）、中量营养元素（钙、镁、硫）、微量营养元素（铁、锰、铜、锌、硼、钼、氯等）和有益元素（硒、钠、稀土元素），这些元素在植物的各项生理代谢过程具有重要的调控作用［5］，不仅影响药效成分的形成和积累，而且与药材自身的药效也紧密相关［6-7］。

款冬花在我国甘肃、山西、河北等地均有较大规模种植。甘肃临夏回族自治州自然气候变化多样，2/3的耕地分布在高寒阴湿、干旱和二阴地区，其南部的积石山、和政、康乐、临夏等州县适宜款冬花生长，是款冬花的生态适宜区［8-9］。

本文通过测定临夏不同产地款冬花中有效成分及矿质元素的含量，比较不同产地的差异，并通过双变量相关性分析研究了款冬花中有效成分与矿质元素间的关系，以期揭示影响款冬花活性成分含量的主导因子，为款冬花生态种植的合理施肥和品质提升提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试样品

10个产地共30份供试样品采自临夏州南部县的不同村组，分别为：（1）HZ1（和政县卜家庄乡卜家庄）、（2）HZ2（和政县马家堡乡马家堡）、（3）HZ3（和政县官滩沟乡官滩沟）、（4）JSS1（积石山县中咀岭乡庙岭村）、（5）JSS2积石山县癿蔵镇纳莫沟村、（6）LX1（临夏县漫路乡漫路村）、（7）LX2（临夏县漫路乡小沟门村）、（8）KL1（康乐县五户乡朱家村），（9）KL2（康乐县五户乡四社）、（10）KL3（康乐县五户乡阴山）。所有样品均经福建省亚热带植物研究所鉴定为款冬的干燥花蕾。

1.2 试剂、仪器与设备

使用的试剂包括：新绿原酸标准品购自Sigma-Aldrich（美国密歇根州圣路易斯）；绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸A、新绿原酸B、新绿原酸C购自成都Mann-Stewart生物技术有限公司；芦丁和款冬酮购自德思特生物技术有限公司；甲醇为分析纯，购自吉安豪迈精细化工实业有限公司；乙醇为分析纯，购自西陇科学股份有限公司；甲酸为分析纯，购自上海麦克林生化公司；乙腈为色谱纯，购自Tedia公司（美国）。元素标准溶液均购自安捷伦公司（美国），其中混标1：内含钾(K)、钙(Ca)、钠(Na)、镁(Mg)、铁(Fe)各1000 μg/mL；混标2：内含铝(Al)、锰(Mn)各100 μg/mL；混标3：内含锂(Li)、钒(V)、铬(Cr)、钴(Co)、镍(Ni)、铜(Cu)、锌(Zn)、铷(Rb)、锶(Sr)、镉(Cd)、铯(Cs)、钡(Ba)、铅(Pb)、铀(U)各10 μg/mL；混标4：内含硼(B)、磷(P)、钛(Ti)、锗(Ge)、锆(Zr)、钼(Mo)各10 μg/mL。

使用的仪器包括：Waters Acquity UPLC仪(Waters，包括Waters Acquity BEH C18色谱柱、自动进样器、Binary溶剂管理系统，二极管阵列检测器DAD，柱温箱和化学工作站）；Milli-Q Direct 8水纯化系统（法国）；BS124S、BS423S Sartorius电子天平（德国）；SB25-12DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；DK-80型电热恒温器（上海精宏实验设备有限公司）；KDM型调温电热套（山东华鲁电热仪器有限公司）；电感耦合等离子体光谱仪iCAP 7200(Thermo)；电感耦合等离子体质谱仪iCAPQ(Thermo)；元素分析仪Flash 2000 CHNS/O(Thermo Fisher)。

1.3 绿原酸类成分、芦丁和款冬酮的含量测定

1.3.1 供试品溶液的制备 绿原酸类及芦丁测试样品的制备：将款冬花样品粉碎过80目筛，精密称定1 g样品，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇20 mL，称重，超声处理1 h，放冷，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀后过45 μm孔径滤膜制得。

款冬酮测试样品的制备：款冬花过80目筛，精密称定1 g样品，置具塞锥形瓶中，加入乙醇20 ml，称重，超声处理1 h，放冷，用乙醇补足减失的重量，摇匀后过45 μm孔径滤膜制得。

1.3.2 色谱条件 绿原酸类成分、芦丁和款冬酮均采用超高效液相色谱法(UPLC)测定，绿原酸类成分、芦丁测试色谱条件：色谱柱为Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm），柱温35℃，流动相A为0.1%甲酸，流动相B为乙腈，流速0.3 mL/min。洗脱条件：0~5 min，A相由90%线性变化为75%；5~6.5 min，A相75%线性变化为45%；6.5~9 min，A相由45%线性变化为15%。DAD检测器。款冬酮测试色谱条件：色谱柱为Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，柱温35 ℃，以甲酸+水（85∶15）为流动相，检测波长220 nm。标准品及典型样品的色谱图见图1。

图1 标准品溶液（a、c）和款冬花样品溶液（b、d）的UPLC图谱

1.4 矿质元素的测定

款冬花样品用自来水洗净，再用去离子水漂洗，置电热恒温干燥箱中以50 ℃烘至恒重，用玛瑙研钵研细，样品过100目筛。测定款冬花样品中的28种矿质元素，N采用动态闪烧确定含量，炉950℃（逐步升温：400、600、800、950 ℃），柱箱65 ℃，载气设为140 mL/min，参考气设为100 mL/min吹扫进样口，进样延迟12 s，氧气设为250 mL/min，注入5 s；K、Ca、Na、Mg的含量采用电感耦合等离子体光谱ICP-OES测定，以HNO3为消解体系对样品进行高压罐消解，RF Power 1150 W，雾化气流速0.5 L/min，冷却气流速12.0 L/min，辅助气流速0.5 L/min，吹扫气流速trickle（微量）；Fe、Al、Mn、Li、V、Cr、Co、Ni、Cu、Zn、Rb、Sr、Cd、Cs、Ba、Pb、U、B、P、Ti、Ge、Zr、Mo采用电感耦合等离子体质谱ICPMS测定，以HNO3为消解体系对样品进行高压罐消解，等离子体射频功率1400 W；雾化气（氩气）体积流量1.08 L/min；等离子流量14 L/min；雾化室温度3 ℃；重复采集3次，结果取平均值。

1.5 数据处理

试验数据使用Microsoft Excel 2010软件进行整理；运用SPSS 23.0软件的Pearson相关系数法对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 临夏不同产地款冬花中有效成分含量特征

10个不同产地款冬花样品的有效成分含量见表1。按照药典中规定的质量分析指标成分要求，款冬酮含量除样品HZ2、JSS1外，其余样品均达到标准值；在绿原酸类成分中，绿原酸含量最高，其次依次是异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、隐绿原酸、新绿原酸。通过对比不同产地的测试结果发现，HZ1的款冬酮、绿原酸、异绿原酸A含量最高；LX2的异绿原酸B、异绿原酸C及新绿原酸含量最高；LX1的隐绿原酸含量最高；HZ2的款冬酮和芦丁含量最低；HZ3的款冬酮含量高于药典标准，但所有的绿原酸类成分的含量均为最低。

表1 临夏不同产地款冬花样品的有效成分质量分数 mg/g

2.2 临夏不同产地款冬花矿质元素的含量特征

10个产地样品的矿质元素的检测结果见表2。临夏不同产地款冬花矿质元素的含量从高至低依次排序为K、N、Ca、P、Mg、Al、Fe、Na、Ti、Mn、Rb、B、Ba、Sr、Zn、Cu、Cr、V、Ni、Li、Zr、Pb、Mo、Cs、Co、Ge、Cd、U。HZ1样品中N、Na、K、P、Cu、Rb、Mo的含量最高，Ca、Fe、Al、Ti、Li、V、Cr、Mn、Co、Ni、Ge、Zr、Cd、Ba、Pb、U的含量最低；KL1样品中Mg、Fe、Al、Ti、Mn、Co、Ge、Zr、Cs的含量最高；HZ2样品中Ca、Ba、Pb、U的含量最高，N、K、P含量最低；HZ3样品中Li、B的含量最高，Na，Sr含量最低；JSS1样品中Sr的含量最高，B、Zn、Rb的含量最低，JSS2样品中Cr、Ni、Cd的含量最 高；LX1样 品中Mg、Cu、Cs的含量最低；LX2样品中V、Zn的含量最高，Mo的含量最低。根据国家药典委员会发布的《中国药典》2020年版四部中9302中药有害残留物限量制定指导原则，Cu、Cd、Pb均未超标。

表2 临夏不同产地款冬花中矿质元素的质量分数 mg/kg

2.3 有效成分与矿质元素的相关性

本研究对8种有效成分与28种矿质元素这2组变量进行相关性分析，以Pearson系数及P值作为标准判断这2组变量间的相关性（表3）。结果表明，款冬酮的含量与N（0.751）、P（0.686）的含量呈显著相关，与K（0.874）的含量呈极显著相关，与 Ca(-0.762)、Ti(-0.666)、V(-0.635)、Co(-0.654)、Sr(-0.678)、Ba(-0.701)、Pb(-0.663)的含量呈显著相关，与U(-0.810)的含量呈极显著相关；芦丁的含量与N（0.693）、K（0.727）、Rb（0.690）的含量呈显著相关；新绿原酸含量与Li(-0.842)、B(-0.773)的含量呈极显著相关；绿原酸与Li(-0.802)的含量呈显著相关；异绿原酸A含量与Li(-0.741)的含量以及异绿原酸C与Li(-0.688)的含量均呈显著相关。

表3 款冬花有效成分与无机元素的Pearson相关系数分析

3 讨论

本研究测定了临夏10个不同产地的款冬花样品中的8种有效成分及28种矿质元素的含量，并进行了双变量相关性分析，其结果对于了解矿质元素对款冬花有效成分产生的影响，以及对生产过程中对有益矿质元素的富集、重金属及有害元素的防避提供了科学依据，对款冬花药材的田间施肥、品质提高及安全使用均具有指导意义。

2020年版《中国药典》沿袭了2015年版一部款冬花项的规定，含有量指标仅检测款冬酮1种成分，有学者指出这不能全面反映款冬花的质量［3-4］。在本研究中，总绿原酸类成分在10个样品中的含量的均值为43.25 mg/g，是含量较高的主要成分，其药理与款冬花的主要用途具有一致性［10-11］。从统计分析结果看，款冬酮的含量与芦丁的含量呈极显著相关，在样品中较为一致；而对于绿原酸类成分而言，尽管款冬酮的含量与绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的含量呈显著相关，并不能排除迥异个体的出现：HZ3样品中的款冬酮含量达标，但其新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的含量在所有样品中均为最低，且低于款冬酮未达标的HZ2、JSS1样品。款冬花主要有效成分含量与款冬酮含量不一致的情况，表明除款冬酮外，有必要增加其他成分如绿原酸类为分析检测性指标。绿原酸类成分与款冬酮含量的分异缘于其在合成中分属不同的代谢路径，光照、水分、温度、土壤等环境因子的差异均可导致其含量的变化，绿原酸类成分的合成对光照更敏感［12］。

矿质元素是药材质量评价的指标，同时也是影响药材有效成分的主要因子。HZ1样品中的款冬酮、绿原酸、异绿原酸A和芦丁在所有样品中的含量最高，其对应的主量矿质元素中N、P、K的含量也最高，而Ca、Al的含量较低；HZ2样品中有效成分的含量相对较低，其对应的主要矿质元素中N、P、K的含量最低，而Ca的含量最高，Al的含量为次高；从双变量相关性分析来看，款冬酮的含量与N、P的含量呈显著正相关，与K的含量呈极显著正相关，与Ca的含量呈显著负相关；芦丁的含量与N、K的含量呈显著正相关，与P的含量呈正相关，与Ca、Al的含量呈负相关。结合测试结果分析，临夏州的款冬花在种植过程中应增施N、P、K肥，同时应避开Ca、Al含量高的土壤。