大樱桃矮化砧木吉塞拉6号的组织培养和快速繁殖技术研究

毕海林，木永青，郭 淼，和加卫，王朝文，和志娇，杨燕林，杨正松*

（1.云南省农业科学院 高山经济植物研究所，云南 丽江 674199；2.丽江蓝玛生物科技开发有限责任公司，云南 丽江 674100）

大樱桃矮化砧木吉塞拉6号(Gisela 6)由德国育成，是酸樱桃(Prunus cerasus L)与灰毛叶樱桃(Prunus canescens)进行种间杂交培育的三倍体杂种，其植物学性状特点类似于灰毛叶樱桃，在欧洲、北美地区被广泛种植，并于1998年经美国引入我国，于2004年12月通过国家林业和草原局林木良种审定。塞拉6号与大多数大樱桃品种的亲合性良好，具有明显的矮化、丰产、早实性强、抗病、耐涝、土壤适应范围广、固地性能好、抗寒、产量高等优点。栽植嫁接苗3年可见果，5年可达丰产。吉塞拉6号与大樱桃品种的适配性好，很少出现排斥现象，这也是吉塞拉6号能够迅速在我国推广应用的原因［1-2］。吉塞拉6号为无性系砧木，不能采用种子繁殖；扦插繁殖需要大量的枝条且速度较慢，不能在短期内获得大量砧木苗。本文对大樱桃矮化砧木吉塞拉6号进行了组织培养研究，摸索出了吉塞拉6号的组织培养及其快速繁殖技术，为大樱桃矮化砧木吉塞拉6号的工厂化育苗以及大樱桃的产业发展奠定了物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

吉塞拉6号枝条取自云南省农业科学院高山经济植物研究所丽江美自科研基地。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒与初代培养 以吉塞拉6号带腋芽茎段作为外植体。4月初对吉塞拉6号的嫩枝条进行处理，剪成带1个腋芽的茎段。外植体消毒和接种按以下方式进行：将茎段用洗衣粉液浸泡10 min，流水冲洗2 h，然后放入超净台，70%乙醇消毒30 s，无菌水浸洗3次；再用0.1%升汞溶液消毒6 min，无菌水浸洗5次后供接种使用，茎段接种到诱导培养基上。8种诱导培养基：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA上，培养温度为(25±2)℃，光照强度3000 lx，光照时间12 h/d，培养基pH值5.8，蔗糖30 g/L。每瓶培养基接种1个茎段，以50个茎段为1个组合，分别重复3次，接种后观察并记录茎段的生长变化情况，45 d后对茎段的生长情况进行统计分析。

1.2.2 继代增殖培养 培养基均为MS培养基。将初代培养腋芽萌发的新枝剪成约1 cm的茎段，接种到含不同激素配比的增殖培养基上。8种增殖培养 基：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，培养条件与初代培养相同，每瓶接4个茎段，45 d后测量苗的高度、丛生芽数，以及统计新转接的培养瓶数，每种配方统计测量3瓶。

1.2.3 试管内生根培养与炼苗移栽 将试管苗剪去基部愈伤组织，并剪成约3 cm的茎段，接种到生根培养基中。4种生根培养基：1/2 MS+0.5 mg/L IBA+2.0 g/L AC、1/2 MS+1.0 mg/L IBA+2.0 g/L AC、1/2 MS+1.5 mg/L IBA+2.0 g/L AC、1/2 MS+2.0 mg/L IBA+2.0 g/L AC，其中，AC为活性炭，每瓶接种20苗，培养条件与初代培养及继代培养相同，蔗糖为15 g/L。第45天观察统计其生根的情况，每种配方统计测量3瓶。

炼苗移栽按采用以下4种方式：(1)生根培养第3天进行试管苗炼苗，第10天进行移栽；(2)生根培养第13天进行试管苗炼苗，第20天进行移栽；(3)生根培养第23天进行试管苗炼苗，第30天进行移栽；(4)生根培养第33天进行试管苗炼苗，第40天进行移栽。

试管苗炼苗即将培养瓶微开盖，3 d后将瓶盖打开1/3左右，再过2 d将瓶盖去除，2 d之后进行洗苗并移栽至苗床。以草炭土+珍珠岩(10∶1)作为苗床基质，移栽前用消毒剂将苗床进行消毒，移栽时剪去部分叶片，移栽后要注意保持空气相对湿度，并遮阴养护。30 d后统计试管苗的移栽成活率，并测量苗的生长量。

1.2.4 试管外生根 将试管苗剪去基部愈伤组织，并剪成约2 cm的茎段，蘸1000 mg/L IBA后分别扦插在粉碎苔藓、草炭土+珍珠岩(20∶1)、椰糠+珍珠岩(20∶1)、松针粉+珍珠岩(20∶1)等4种基质中，基质分别盛放在70孔穴盘中，每种基质观察3盘，扦插后放入大棚的塑料小拱棚内，观察生根情况，并在第45天统计生根情况；第75~90天将穴盘苗上营养钵或进行大田移栽。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对吉塞拉6号初代培养的影响

由表1可以看出，吉塞拉6号带腋芽的茎段在初代培养基中腋芽很快就开始萌发，多数在培养的第5天就开始萌发（图1A）。8种培养基中腋芽的萌发率均在78.0%以上，在添加NAA的培养基中腋芽的萌发率比添加IBA的培养基中腋芽的萌发率略高，基本在80%以上，并且添加NAA的培养基中腋芽萌发后伸长较多。第45天时进行统计测量，伸长的腋芽枝条长度普遍在3 cm以上。另外，对比4种激素浓度发现，较高浓度的生长素NAA和IBA更有利于吉塞拉6号腋芽枝条的萌发和生长，并且NAA比IBA的促进效果更显著。因此，选择MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA可作为吉塞拉6号较佳的初代培养茎段腋芽的启动培养基。

图1 吉塞拉6号在各培养阶段的生长情况

表1 不同激素配比对吉塞拉6号外植体萌发及生长的影响

2.2 不同激素配比对吉塞拉6号不定芽分化和增殖的影响

由表2可以看出，在不同浓度6-BA和NAA的继代培养基中，吉塞拉6号均能较好地增殖，苗的基部均形成少量淡绿色愈伤组织，并分化形成较多的丛生芽（图1B）。在6-BA浓度为1.0 mg/L时，随着NAA浓度的升高，产生丛生芽数也明显随之增多；在6-BA浓度为2.0 mg/L时，随着NAA浓度的升高，产生的丛生芽数也明显增多。但是比较2种6-BA浓度发现，在NAA浓度相同时，6-BA浓度为2.0 mg/L的平均丛生芽数反而比6-BA浓度为1.0 mg/L时略少。不同浓度6-BA和NAA的培养基中苗高的差异不明显。1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA组合的增殖系数最高，为11.03。故MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA为吉塞拉6号较佳的增殖培养基。

表2 不同激素配比对吉塞拉6号不定芽分化和增殖的影响

2.3 生根培养与炼苗移栽

2.3.1 不同浓度IBA对吉塞拉6号生根的影响 由表3可以看出，在4种生根培养基中，当苗接种到生根培养基中之后，苗基部逐渐形成淡绿色、紧致的愈伤组织，约6 d后可以看到愈伤组织上出现根原基分化的迹象，随后逐渐伸长成白色根（图1C），再逐渐发育成粗壮的淡黄色被绒毛的肉质根。随着培养基中生长素IBA浓度的升高，苗基部愈伤组织也稍微随之增大，生根数略微降低，但是根长却随IBA浓度的升高而伸长，生根率随IBA浓度的升高而表现出略微降低的趋势。综合来看，1/2 MS+0.5 mg/L IBA+2.0 g/L AC是吉塞拉6号较佳的生根培养基。

表3 不同浓度IBA对吉塞拉6号生根的影响

2.3.2 不同诱导生根时间对吉塞拉6号生根与成活率的影响 由表4可以看出，吉塞拉6号试管苗在生根培养基中诱导生根第10天移栽时，根还很短，根数也很少，多为表面光滑的白色肉质根，移栽时不用剪根，但生根率较低，仅为63.6%，移栽后的成活率也较低，这可能是根发育尚不成熟，在一定程度上影响了苗的正常生长。吉塞拉6号试管苗诱导生根第20天进行移栽时，根还较短，平均根长为1.14 cm，但根数较多，是表面光滑的淡黄色肉质根，生根率较高，达到87.5%，并且移栽后的成活率也较高，达到90.4%，说明此时根已经发育较成熟，且由于移栽时不需要剪根，对根的损伤较小，所以苗在移栽后的成活率高。随着吉塞拉6号试管苗在生根培养基中诱导生根时间的延长，根越来越长，平均根数变化不明显，生根率增长也不明显，根逐渐发育成表面被绒毛的淡黄色粗但松软的肉质根，移栽时必须剪去底部一大段根，这将导致根系在一定程度上受到损伤，移栽后苗的成活率也略微降低。综上所述，吉塞拉6号生根培养第13天时进行试管苗炼苗，第20天时移栽，移栽后的成活率较高，为最佳的生根诱导和移栽时间。

表4 不同诱导生根时间对吉塞拉6号生根与成活率的影响

2.4 不同基质对吉塞拉6号培养瓶外生根的影响

由表5可以看出，在4种基质中，吉塞拉6号枝段基部均在第8天逐渐产生少量愈伤组织，第12或13天以后愈伤组织及其稍上方逐渐长出白色短根。吉塞拉6号在4种基质中的生根率差异不明显，均达到88%以上，其中以粉碎苔藓基质的生根率最高，为90.6%；在4种基质中苗生根一段时间后，均开始逐渐长高，其中粉碎苔藓、草炭土+珍珠岩2种基质中的苗生根后长高较多，但两者差异不大。综合来看，粉碎苔藓是吉塞拉6号较好的瓶外生根基质。

表5 不同基质对吉塞拉6号培养瓶外生根的影响

3 讨论与结论

在云南用于大樱桃生产的砧木中，吉塞拉6号砧木应用最多，占总面积的60%；西南樱桃、细齿樱桃次之，占总面积的30%；其余砧木应用则相对较少，仅占总面积的10%［3］。目前，有的地方还在采用乔化砧木作为大樱桃砧木，但樱桃的产量比较低，因此加大优质矮化砧木的繁育，能大力推动云南大樱桃产业发展。国内大樱桃矮化砧木的繁育技术已有很多报道，如刘庆忠等［4-10］对大樱桃矮化砧木吉塞拉系列进行了研究，但是关于不同诱导生根时间对吉塞拉6号生根及炼苗移栽成活率的影响，以及大樱桃矮化砧木培养瓶外生根技术鲜有研究报道。

笔者将大樱桃矮化砧木吉塞拉6号进行培养瓶外生根即基质扦插，整个过程不需要无菌操作，可以组织大量劳动力短期内完成扦插工作，生根后除去小拱棚，过渡一段时间后可直接上营养钵或进行大田移栽，这样可以在一定程度上缩短育苗周期，并且有效地降低育苗成本，将大力促进大樱桃矮化砧木吉塞拉6号优质种苗的规模化生产，进而推动我国大樱桃产业的发展。

在本试验中，虽然吉塞拉6号在粉碎苔藓中的生根情况稍稍好点，但在松针粉中的生根率也较高，总体来看，松针粉的成本较低，因此在一些松针较丰富的地方，尤其在云南，可以因地制宜地选用松针粉作为吉塞拉6号的生根基质。

本试验表明，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA为吉塞拉6号较佳的初代培养茎段腋芽启动培养基；MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA为吉塞拉6号较佳的继代增殖培养基；1/2 MS+0.5 mg/L IBA+2.0 g/L AC是吉塞拉6号较佳的生根培养基，生根培养第13天进行试管苗炼苗，第20天进行移栽，移栽后的成活率较高，为最佳的生根诱导和移栽时间；粉碎苔藓是吉塞拉6号较好的瓶外生根基质。