精胺通过降低SAICAr改善ADSL缺陷症的效用研究

黄 楠，彭 勃，徐 蕾，潘武广，赵德志，郭 蕾，敖妍冉，朱 威★，潘秋辉★

（1.同济大学附属第十人民医院，上海 200072 ；2.暨南大学，广东 广州 510632 ；3.上海交通大学医学院附属儿童医学中心，上海 200127 ；4.广州君赫生物科技有限公司，广东 广州 510663）

腺苷酸琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate lyase deficiency，ADSL）缺陷症是一种代谢性疾病，目前尚不可治愈[1]。ADSL 是腺嘌呤从头合成代谢途径中重要的双功能酶，主要参与将体内有害代谢物产物琥珀酰氨基咪唑甲酰胺核苷（succinylaminoimidazole carboxamide riboside，SAICAR）裂 解 催 化 形 成 氨基米唑甲酰胺核苷酸（aminoimidazole carboxamide ribotide，AICAR）的反应[1-2]。因SAICAR 可在生理条件下自然降解成为SAICAr，故通常检测SAICAr 来代表SAICAR 的含量[3]。ADSL 缺陷症一般见于出生至婴幼儿期，主要是由于患者体内的ADSL 发生了突变或者缺失，导致嘌呤合成途径中的有害代谢物产物SAICAr 在体液中过量堆积，从而影响患儿生长发育，主要涉及器官包括脑、骨骼肌、眼睛，主要症状有大脑发育失常、语言缺乏、小头畸形、癫痫、肌肉痉挛、语言缺乏、运动呆滞等[1,4]。精胺（Spermine）大量存在于包括牛肉、猪肉和禽肉在内的新鲜肉类中，是哺乳动物产生的最重要的多胺之一[5]。据报道，精胺除了在包括离子通道调节、骨骼发育、抑制脂质形成等多种细胞生理过程中发挥重要作用外，还与多种肿瘤的发展密切相关[5-6]，但其在ADSL 缺陷症治疗中的效用尚无文献报告。我们在本研究中建立了质谱检测SAICAr 的方法，首次发现精胺可明显降低体外细胞SAICAr 的堆积，可能达到治疗或改善ADSL 缺陷症的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

人非小细胞肺癌A549 细胞和人乳腺癌MDAMB-231 细胞购自中国科学院上海细胞库；胰蛋白酶、DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）和青/ 链霉素（PS）购自美国GIBCO 公司；磷酸盐缓冲液（PBS）购自上海生工生物公司；精胺购自美国Sigma 公司；SAICAr标准品购自美国Thermo 公司。

1.2 细胞培养

A549 和MDA-MB-231 细胞用DMEM 完全培养液（含10%FBS 和1%PS）于5% CO2、37℃的培养箱中培养。每2 ～3 天更换一次培养液，选取处于对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3 方法

1.3.1 质谱法检测细胞及血清中SAICAr 含量 我们首先用-20 ℃预冷甲醇稀释SAICAr 标准品，质谱采用PRM 模式。于正离子条件下，CE=30 V，标准品浓度为10 μg/mL 时检测到了SAICAr 的单一峰。之后，通过-20 ℃预冷甲醇梯度稀释标准品，制作了标准曲线，R 方为0.9978，可满足后续检测需求。在此基础上，我们后续研究中将精胺处理后（实验组）及对照组的细胞沉淀样品用于质谱检测，其中各组质谱图中的峰面积代表检测物质含量。由于样品蛋白浓度不同，其代表着样品细胞量不同。因此，将各样品的峰面积除以各自的蛋白浓度，进行均一化处理以后，再将各实验组与各自对应的对照组进行逐一比对，计算出精胺对细胞中SAICAr 含量的影响。

1.3.2 精胺体外给药实验 将处于对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231 细胞和肺鳞癌A549 细胞以每孔1.0×104的密度铺于6 孔板中（200 μL/ 孔），置于5%CO2、37 ℃的培养箱中培养过夜后，实验组加入精胺（5 μmol/L），对照组加入同等体积的1×PBS，每组设3 个副孔，继续培养细胞48 小时后，离心收集细胞沉淀备用，质谱检测各组细胞中的SAICAr 水平。

2 结果

2.1 质谱检测细胞及血清中SAICAr 含量的方法学建立

SAICAr 是嘌呤合成过程中的中间体，分子结构式如图所示（图1A）。为了评估细胞及血清中的SAICAr 含量，我们需要建立一种准确有效的定量方法。质谱是目前代谢产物分析中最常见的技术之一，具有检测灵敏度高、分析物质的分子质量范围宽等多种特点，可以快速、微量、精确地检测细胞及血清中SAICAr 的含量。为了有效地检测细胞中SAICAr 的含量，我们购买了SAICAr 的标准品用于质谱检测方法学的建立。质谱采用PRM 模式，在正离子条件下（CE=30 V，标准品浓度10 μg/mL）进行检测。结果显示，质谱能够检测到SAICAr 的单一峰存在（m/z=455.08098, RT=0.98 和RT=1.26）（图1B）。同时为了后续精确测量样品中SAICAr 含量，我们用预冷甲醇梯度稀释标准品，制作了标准曲线，R 方为0.9978，可满足后续检测需求（图1C）。

2.2 体外证实精胺具有显著的靶向降低SAICAr水平的作用

据文献报道，SAICAr 在肿瘤细胞中含量较高[7]，因此我们通过TCGA 数据库分析了SAICAr 合成酶PAICS 和代谢酶ADSL 在多种肿瘤细胞中的表达水平，挑选出了PAICS 高表达和ADSL 低表达的两种肿瘤，乳腺癌和肺鳞癌（图2A）。这两种肿瘤细胞中合成酶PAICS 的高表达和代谢酶ADSL 的低表达提示其细胞内存在高水平的SAICAr。随后我们使用精胺处理乳腺癌细胞MDA-MB-231 和肺鳞癌细胞A549，通过质谱方法检测了细胞内SAICAr 水平。结果显示，经过精胺处理后，两株细胞内SAICAr 水平均出现明显降低，差异具有统计学意义（图2B 和图2C）。

图2 精胺明显降低体外细胞内的SAICAr 水平

3 讨论与分析

嘌呤从头合成途径广泛存在于各种生物当中，能够将1- 焦磷酸-5 磷酸核糖（PARP）转化为次黄嘌呤核苷酸（IMP），随后进一步合成腺嘌呤核苷酸（AMP）和鸟嘌呤核苷酸（GMP）[2]。嘌呤从头合成过程需要十个酶促反应才能完成相应转化，ADSL和PAICS 是其中重要的双功能酶[8]。ADSL 主要催化SAICAR 裂解成AICAR 以及S-AMP 生成AMP 的反应；而PAICS 为催化嘌呤从头合成途径第六和第七步酶促反应的关键酶，能够将5- 氨基咪唑-4- 羧基核苷酸（CAIR）转化为SAICAr，主要负责SAICAr 的合成[8]。我们前期已发表的研究证实通过干扰PAICS 基因的表达可有效减少人体有毒产物SAICAr 的积累，达到治疗或改善ADSL 缺陷症的目的[9]。因此，我们推测精胺通过降低SAICAr 水平延长ADSL 条件敲除小鼠的存活率的机制可能与干扰PAICS 表达或抑制PAICS酶活性有关，但其中详细的机制仍需进一步探究。

总之，我们在本研究中证实了精胺通过降低SAICAr 水平改善ADSL 缺陷症的效用。值得一提的是，精胺已经有发表已久的国际毒理数据，因此在实验中能够把握好安全剂量[10]。国际公开数据显示，精胺具有较好的安全性[11]。因此，精胺在ADSL 缺陷症药物治疗领域具有广阔的应用和开发前景。