H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril电化学发光识别琥珀酰胆碱

高瑞晗,邱 菲,丛 航

(贵州省大环化学及超分子化学重点实验室,贵州 贵阳 550025)

琥珀酰胆碱是一种烟碱型乙酰胆碱受体阻断剂,常作为骨骼肌松弛剂在临床手术中用作麻醉剂[9-10];但在人体内过量吸收会导致心律失常,严重时甚至会危及生命。因此出于安全考虑,它的使用应受到严格控制。利用色谱法[11-12]和光谱法[10]测定琥珀酰胆碱的含量,具有检测耗时长、检测范围窄、灵敏度低等缺点。这促使我们探索一种更灵敏的方法来分析琥珀酰胆碱。

本文通过引入H2O2增敏发光主体的电化学发光强度,构建基于羧甲基取代benzo[3]uril的电化学发光传感器,并利用电化学发光手段考察胆碱类物质与其主客体作用及灵敏性识别。基于主客体相互作用,利用其空腔包结琥珀酰胆碱,在H2O2增敏条件下,大环主体羧甲基取代benzo[3]uril的电化学发光强度增强,从而建立了一种新的、灵敏的方法以检测琥珀酰胆碱。

1 实验部分

1.1 试剂

30% H2O2,琥珀酰胆碱,氢氧化钠,磷酸盐缓冲溶液(PBS),试剂均购于Aldrich Alfa Aesar化学试剂公司、北京伊诺凯公司;所有实验用水为超纯水。羧甲基取代benzo[3]uril由我们课题组开发方法[8]合成。

1.2 仪器

ECL测试和电化学信号测试均使用LK5100电化学发光分析系统(天津兰力科高科技公司);实验用常规三电极体系,工作电极为玻碳电极(Φ=3 mm),参比电极为Ag/AgCl电极,对电极为铂丝电极。

1.3 电极预处理

将玻碳电极用直径为3 mm的α-Al2O3抛光粉进行打磨,后依次用超纯水、无水乙醇分别超声5 min,直至玻碳电极表面呈镜面般光滑。实验采用的是工作电极为玻碳电极,参比电极为Ag/AgCl电极,对电极为铂丝电极的经典三电极体系。

1.4 电化学发光测试

每次量取2 mL的测试液于比色皿中,用裸电极测试在不同pH条件、不同浓度共反应试剂下进行羧甲基取代Benzo[3]uril电化学发光实验。电化学发光实验参数设置:光电倍增管电压(PMT)为800 V,电压扫描范围为-0.2～0.9 V,灵敏度为4档。

1.5 电化学发光滴定

配制2.0×10-4mol/L羧甲基取代Benzo[3]uril与琥珀酰胆碱浓度比分别为1∶0,1∶0.25,1∶0.5,1∶0.75,1∶1.0,1∶1.25,1∶1.5,1∶1.75,1∶2.0的溶液。

2 结果与讨论

2.1 羧甲基取代benzo[3]uril电化学发光性质研究

羧甲基取代benzo[3]uril在中性和碱性介质中具有优异的水溶性,通过测试在不同pH值下的电化学发光性质,考察其在不同pH条件下的电化学发光行为,如图1所示。

图1 不同pH条件下羧甲基取代benzo[3]uril的电化学发光强度-时间曲线图Fig.1 ECL intensities-time curves of carboxymethyl substituted benzo[3]uril at different pH

实验发现pH值在7.0～12.0时,其电化学发光呈现不同的强度。当pH为7.0时,羧甲基benzo[3]uril的电化学发光几乎不能被观察到。羧甲基取代benzo[3]uril的阴极电化学发光强度随着酸性的逐渐减弱呈现逐渐升高的趋势。当pH=10.0时,开始观察到在+753 mV时出现阳极发光。在pH=10.0～12.0时,随着氢氧根离子浓度的增加,阳极发光增强并伴随其阴极电化学发光的逐步减弱。因此,其电化学发光可以归因于不同pH条件下溶液发生电化学反应产生的超氧自由基与大环化合物羧甲基benzo[3]uril形成激发态分子的弛豫现象,这类似于鲁米诺在碱性溶液条件下的发光机理[13-14]。基于实验结果的启发,我们设想在溶液中加入H2O2,通过电化学反应生成超氧自由基,增强羧甲基benzo[3]uril的电化学发光,从而建立一个H2O2增敏的高灵敏响应的电化学发光传感器,并用于识别环境体系中低浓度的胆碱类物质。H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril电化学发光传感器检测琥珀酰胆碱示意图如图2所示。

图2 H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril电化学发光传感器检测琥珀酰胆碱示意图Fig.2 Diagram of H2O2 sensitized carboxymethyl substituted benzo[3]uril electrochemiluminescence sensor for the detection of succinylcholine

2.2 H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril电化学传感器条件优化

考虑到电化学发光传感器普遍应用在生物分析和免疫检测领域,我们尝试在pH=7.0的中性水溶液条件下构建以羧甲基取代benzo[3]uril为主体的电化学发光传感器,并通过加入H2O2来达到增强羧甲基取代benzo[3]uril电化学发光的目的。如图3所示,未加入H2O2时,大环化合物的电化学发光很弱。随着双氧水的加入,羧甲基取代benzo[3]uril的电化学发光强度逐渐升高。在浓度为0.100 mol/L时,电化学发光强度达到峰值16 000,可能由于H2O2电化学反应提供了反应所需的超氧自由基。但是,随着H2O2的加入(0.500或1.000 mol/L),发光强度下降,表明高浓度的超氧自由基发生自淬灭。因此,后续实验采用0.100 mol/L H2O2进行增敏。

图3 电化学发光传感器在不同浓度H2O2下共反应的电化学发光强度-电压曲线Fig.3 ECL intensity-voltage curves of the ECL sensor at different concentrations of H2O2 co-reaction

在上述优化条件下,采用包含0.100 mol/L H2O2的羧甲基取代benzo[3]uril-H2O2电化学发光传感器定量检测pH=7.0溶液中琥珀酰胆碱的含量。我们通过测试不同琥珀酰胆碱浓度下的电化学发光性质,考察传感器电化学发光行为。如图4所示,羧甲基取代benzo[3]uril的电化学发光强度随着琥珀酰胆碱浓度的增加而降低,这可能是benzo[3]uril和琥珀酰胆碱发生主客体作用形成稳定的包结物,由此减少了羧甲基取代benzo[3]uril激发态产生的结果。在琥珀酰胆碱浓度为1.0×10-12～1.0×10-4mol/L范围内,羧甲基取代benzo[3]uril的电化学发光强度变化值与琥珀酰胆碱浓度的负对数之间呈现良好的线性关系,得到相应的线性校正曲线:I=-354.12lgC-959.38,其中R2=0.993 7,如图5所示。通过相应的计算得到该传感器对琥珀酰胆碱实现超低检测限为1.0×10-15mol/L (S/N=3 ),其灵敏度远高于以往研究中采用的荧光光谱、紫外光谱和高效液相色谱检测方法(表1),表明羧甲基取代benzo[3]uril电化学发光传感器具有优越的性能。

图4 电化学发光传感器与不同浓度琥珀酰胆碱的响应电化学发光强度-时间曲线Fig.4 ECL intensity-time curves of the ECL sensor in response to different concentrations of succinylcholine

图5 电化学传感器电化学发光强度与琥珀酰胆碱浓度的线性关系Fig.5 Linear relationship between the intensity of electrochemiluminescence and the concentration of succinylcholine

表1 不同检测手段对琥珀酰胆碱检出限比较Tab.1 Comparison of detection limits of succinylcholine by different detection methods

3 结论

基于羧甲基取代benzo[3]uril这种新型的水溶性电化学发光载体,初步考察了羧甲基取代benzo[3]uril的电化学发光机理,通过溶液中的超氧自由基促进电子转移,进而生成羧甲基取代benzo[3]uril激发态分子,激发态分子跃迁至基态时产生发光现象。为提高超氧自由基浓度,引入共反应试剂H2O2,制备了一种基于H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril的电化学发光传感器,并将其应用于琥珀酰胆碱的灵敏检测,检出限低至1.0×10-15mol/L。基于此原理建立了一个基于H2O2敏化羧甲基取代benzo[3]uril传感器实现对琥珀酰胆碱的高灵敏高选择性识别。将大环化合物羧甲基取代benzo[3]uril应用在电化学发光领域,提高电化学分子检测的筛选性,对拓宽超分子化学研究领域具有重要意义。