葛根素通过抑制背根神经节Nav1.7 上调治疗神经根性疼痛 *

张玮丽 唐 倩 邓 镇 赵元淑 钟 祎

（广州医科大学基础医学院，广州 511436）

腰椎间盘突出症 (lumbar disc herniation, LDH) 是临床常见疾病，也是神经根性疼痛的主要病因。主要表现为单侧下肢的痛觉过敏，痛觉超敏和自发性疼痛，以及腿麻无力、腰部僵硬和活动受限，严重者引起马尾神经受压、大小便失禁[1]。长期的慢性疼痛不仅损害病人的身心健康，也带来沉重的社会和经济负担，深入研究神经根性疼痛的发病机制，具有重要临床意义。

外周敏化是指背根神经节 (dorsal root ganglia, DRG)神经元上离子通道表达和功能的改变，进而引起神经元兴奋性增加，导致异常放电并产生过多的痛觉信号[2]，外周敏化是神经根性疼痛发生的重要病理生理学机制。同行的研究及我们的预实验发现自体髓核(nucleus pulposus, NP)移植大鼠DRG 上电压门控性钠通道Nav1.7 表达增加[3]，并且在神经损伤或者高血糖引起的慢性疼痛中，均发现DRG 中致炎细胞因子TNF-α 上调是电压门控性钠通道表达及功能上调的重要原因[4,5]。因此我们推断抑制DRG 组织的炎症反应可以通过降低外周敏化治疗神经根性疼痛。目前临床治疗LDH 的主要手段是通过外科手术摘除病变椎间盘，但是手术费用较高并存在一定风险。本研究以神经炎症反应为切入点，探究对神经炎症和外周敏化均有抑制作用的新药物，以期为治疗LDH 提供新的实验室依据。

葛根素 (puerarin, PU) 是植物葛根中提取的一种药物，广泛应用于高血压、冠心病、心梗等心血管疾病。近年来的研究发现葛根素对神经损伤和糖尿病引起的慢性疼痛有治疗作用[6～8]，本课题组既往报道了腹腔注射葛根素明显降低NP 移植大鼠脊髓Toll-like receptor 4 (TLR4) 的表达，抑制脊髓小胶质细胞的活化和致炎细胞因子的表达[9,10]，这表明葛根素可通过抑制脊髓水平的神经炎症反应治疗神经根性疼痛，葛根素是否可以通过抑制DRG 水平的神经炎症反应降低外周敏化，还值得深入研究。本研究采用自体髓核移植的方法构建大鼠LDH 模型，从外周神经炎症及外周敏化的角度，探究葛根素缓解LDH 诱导神经根性疼痛的发生机制。

方 法

1.动物

成年雄性SD 大鼠，体重200～250 g，购于广东省实验动物中心（合格证号：No.44002100020691；No.44002100021111；No.44005800010307），统一规范饲养在广州医科大学实验动物中心。所有动物实验依据国际疼痛学会的指导方针[11]，并获得广州医科大学动物伦理委员会的批准（伦理批号GD2019-143）。实验一：取20 只大鼠用完全随机化分组法分成假手术组 (sham,n= 4) 和NP 组 (n= 16)，其中NP 组大鼠分别在术后3 天、5 天、7 天、14天(n= 4)取出同侧L4和L5DRG 和脑脊液，L4DRG用于检测钠通道表达，L5DRG 和脑脊液用于检测TNF-α 含量。实验二：取40 只大鼠用完全随机化分组法分为五组 (n= 8)：①sham 组；②NP 移植组；③NP + PU 组；④NP + Veh 组；⑤NP + PU +TNF-α 组，在 术 后0 天、3 天、5 天、7 天、14 天进行痛行为学检测，第14 天行为检测结束后，每组取4 只大鼠DRG 检测TNF-α 和p-p65 含量，另外4 只大鼠取DRG 检测钠通道表达。

2.主要试剂

葛根素注射液（麦克林生化科技有限公司，货号P816258，中国）经腹腔注射100 mg(kg·d)，连续7 天。大鼠重组TNF-α（货号510-RT）购于R&D Systems 公司（美国），多聚甲醛（PFA，货号16005）和Triton X-100（货号X100）购于Sigma-Aldrich 公司（美国）。大鼠TNF-α ELISA 试剂盒（货号EK0526）购于博士德生物技术有限公司（中国）。本实验用的一抗如下：兔抗TNF-α 抗体（ab6671，Abcam，美国），兔抗p-p65 抗体（#3033，Cell Signaling Technology，美国），兔抗GAPDH抗体（BA1054，博士德，中国），兔抗Nav1.7 抗体（SCN9A，Alomone Labs，以色列）。本实验用的二抗如下：HRP 偶联IgG（BA1054，博士德，中国），Cy3 偶联IgG（BA1031，博士德，中国）。

3.方法

（1）腰椎间盘突出症模型

实验一和二均采用大鼠自体髓核 (neucleus pulposus, NP) 移植方法复制腰椎间盘突出症模型[12,13]。戊巴比妥钠麻醉后，从L4～L5节段行半椎板切除术，暴露L5神经根，用0.9%氯化钠注射液棉球保护手术面。大鼠改仰卧位，从尾椎取出NP (5 mg)，立即转回俯卧位，将NP 轻置于暴露的L5神经根上，避免压迫。逐层缝合肌肉和皮肤。假手术 (sham) 组大鼠行同样的手术操作，但NP 不移植到神经根上。

（2）鞘内置管

实验二：NP 移植手术前2 天进行鞘内置管用于持续给药[14]。麻醉后将充满0.9%氯化钠注射液的无菌PE-10 管（Becton, Dickinson and Company，美国）从脊髓L5～L6椎间隙向头端插入到腰膨大位置，外周端有脑脊液流出为插管成功标志。PE-10管外周端经皮下组织向头端推送，藏于两耳间并烧熔封口。大鼠源性重组TNF-α 用PBS 溶液稀释至0.3 ng/μl，TNF-α（每次10 μl）或者PBS 溶液（溶剂对照）从外周端缓慢注入（q6 h，持续7 天），药物注射后再推注7 μl 无菌0.9%氯化钠注射液保证药物进入蛛网膜下腔，每次注射后烧熔封口。

（3）机械性痛阈和热痛阈检测

实验二：采用经典的up-down 方法检测后肢机械刺激缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)[15]。用vonFrey Filaments（强度依次为：0.41，0.70，1.20，2.04，3.63，5.50，8.51，15.14 g）垂直作用于足底6～8 s，如果大鼠出现迅速的撤足或者舔舐足部，视为阳性反应，否则为阴性反应。从2.04 g 强度开始测试，如果出现阴性反应，则用相邻的更强的刺激强度，如果出现阳性反应，则用相邻的更弱的刺激强度。

采用热平板（7370, Ugo Basile, 意大利）方法检测后肢热缩足反射潜伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)[16]。将热源置于大鼠足底，如果大鼠出现迅速的撤足或者舔舐足部，视为阳性反应。同一只大鼠，同样温度下，取3次TWL的平均值作为结果。术前3 天，每日检测MWT 和TWL 作为基础值对照，行为测试的实验者不清楚对大鼠的分组情况。

（4）Western blot (WB)

实验一和二于大鼠麻醉后，取出L4～L5DRG，迅速置于液氮中，加入含蛋白酶抑制剂（1:100,AR1182，博士德，中国）和磷酸酶抑制剂（1:100,AR1183，博士德，中国）的Tris 缓冲液(15 mmol/L,pH 7.6)中，冰上匀浆并超声破碎。随后低温离心(14,000×g , 20 min)取上清液分装冻存于-80℃。

蛋白质定量(bicinchoninic acid, BCA) 法检测标本蛋白浓度，SDS-PAGE 电泳分离蛋白，并转印到PVDF 膜（#1620264, Bio-Rad, 美国）上。PVDF膜 在 室 温 封 闭1 h 后，加 入 抗TNF-α 或p-p65 或GAPDH 的抗体4℃孵育过夜。洗涤后加入HRP 偶联的IgG 常温孵育1 h，再次洗涤后用超敏ECL 试剂（35055，Pierce，美国）检测免疫复合物。计算机辅助成像分析系统（KONTRON IBAS 2.0，德国）计算条带灰度。

（5）免疫荧光染色

实验一和二：大鼠用0.9%氯化钠注射液灌注冲去血液，再用4% PFA 溶液（溶于0.1 M 磷酸盐缓冲液中，pH 7.4，4℃）灌注固定。取出DRG 组织，继续后固定1 h，随后转入30%蔗糖溶液脱水1 天。用冰冻切片机(Leica CM1900, -20℃)将组织切成16 μm 薄片用于染色。

组织片用含3% 驴血清的0.3% Triton X-100 溶液常温固定1 h，再孵育Nav1.7 抗体4℃过夜，洗涤后常温避光孵育Cy3 偶联的IgG，用荧光显微镜和CCD 扫描相机（Leica，德国）拍照。

（6）ELISA

实验一：取DRG 组织和脑脊液 (cerebrospinal fluid, CSF)，DRG 组织用预冷PBS 溶液匀浆（10 mg组织加入100 μl PBS 溶液）并低温离心取上清液，根据ELISA 说明书，在预包被抗体的96 孔板中，先后加入DRG 上清液或者CSF 反应1.5 h，生物素标记抗体进行反应1 h。PBS 洗去未结合的物质，随后加入亲和素-过氧化物酶复合物反应 0.5 h，再次洗涤并依次加入TMB 显色液和TMB 终止液。450 nm 波长下检测样本吸光度并制作标准曲线做参照。根据标准曲线计算组织中TNF-α 蛋白含量。

4.统计学分析

结 果

1.NP 移植大鼠DRG 中Nav1.7 表达增加，DRG和脑脊液中TNF-α 含量增加

免疫荧光结果显示与sham 组相比，NP 后3 天、5 天、7 天、14 天四个时间段，手术同侧DRG 中Nav1.7 阳性细胞百分比明显增加（见图1A-F, NPvs.sham,F(4,15) = 1782,P< 0.01）；WB 结果显示：与sham 组相比，NP 组大鼠在手术后各时间点，其手术同侧DRG 组织中TNF-α 含量均明显增加（见图1G, NPvs.sham,F(4,15) = 1211,P< 0.01）；ELISA 结果表明：与sham 组相比，NP 组大鼠在手术后各时间点，其手术同侧DRG 组织和CSF 中TNF-α含量均明显增加（见图1H, NPvs.sham,F(4,15) = 373.5,P< 0.01;F(4,15) = 5.216,P< 0.05）。表明NP 移植上调手术同侧DRG Nav1.7，同时引起显著的外周神经炎症反应。

图1 NP 移植后DRG 中Nav1.7 表达增加，DRG 和CSF 中TNF-α 蛋白含量增加 (n = 4)(A-F) 免疫荧光染色发现，与sham 组相比，NP 移植后3～14 天DRG 中Nav1.7 表达增加；Western blot (G) 和ELISA 检测 (H) 均发现，与sham 组相比，NP 移植后3～14 天DRG 组织和CSF 中TNF-α 蛋白表达明显增加*P < 0.05，**P < 0.01，与sham 组相比Fig.1 NP implantation increases Nav1.7 expression in DRG and increases TNF- α expression in both DRG and CSF (n = 4)(A-F) Immunofluorescence staining reveals that compared with sham group, Nav1.7 expression in DRG is increased in rats with NP implantation (group NP) from day 3 to day 14 after surgery; Western blotting (G) and ELISA (H) reveals that compared with group sham, TNF-α protein level is increased in DRG and CSF of rats in NP group from day 3 to day 14 after surgery.*P < 0.05, **P < 0.01, compared with group sham.

2.葛根素明显增加NP 移植大鼠机械性和热痛觉阈值，且外源性给予TNF-α 可逆转葛根素的作用

检测大鼠后肢MWT 和TWL 评估大鼠痛行为。NP 移植组大鼠手术同侧MWT 和TWL 明显降低，持续到术后14 天（见图2, NPvs.sham,t(df) =44.92 for MWT,t(df) = 26.09 for TWL,P< 0.01）。从术前1 h 开始，连续7 天腹腔注射葛根素注射液(100 mg/kg, 每日1 次)，于给药后1 h 进行行为学测试，结果显示PU 明显增加手术同侧后肢MWT和TWL（见图2, NP + PUvs.NP + Veh,t(df) = 39.84 for MWT,t(df) = 15.69 for TWL,P< 0.01），效果可持续至术后14 天；给予葛根素的同时，鞘内给予大鼠重组TNF-α 明显逆转葛根素提高MWT 和TWL的作用（见图2, NP + PU + TNFvs.NP + PU,t(df) =28.98 for MWT,t(df) = 13.77 for TWL,P< 0.01）。表明葛根素可持续提高NP 组大鼠痛觉阈值，缓解机械性痛觉过敏和热痛觉超敏，其镇痛效果可被TNF-α 逆转。

图2 葛根素明显增加NP移植大鼠机械刺激缩足反射阈值(A)和热缩足反射潜伏期(B)，TNF-α可逆转葛根素的作用 (n = 8)**P < 0.01，与sham 组相比，NP 组手术后3～14 天大鼠后肢MWT 和TWL 明显下降；##P < 0.01，与溶剂对照组(NP + Veh)相比，葛根素治疗组(NP + PU)大鼠的MWT 和TWL 明显增加；△△P < 0.01，与葛根素治疗组(NP + PU)相比，葛根素与TNF-α 同时给药组(NP + PU + TNF)大鼠的MWT 和TWL 明显降低Fig.2 Peurarin significantly increases MWT and TWL of rats with NP implantation which is obscured by TNF-α (n = 8)**P < 0.01, compared with sham group, the mechanical MWT and TWL are decreased in rats of NP group from day 3 to day 14 after surgery; ##P < 0.01, compared with group NP + Veh, the MWT and TWL of group NP + PU are significantly increased; △△P < 0.01, compared with group NP + PU, the MWT and TWL of group NP + PU + TNF are significantly decreased.

3.葛根素明显降低NP 移植大鼠脊髓组织中TNF-α 和p-p65 蛋白表达

葛根素给药至术后7 天，于术后14 天取DRG组织，用Western blot 方法检查TNF-α 和p-p65 蛋白水平，与sham 组相比，NP 组大鼠手术同侧DRG中TNF-α 和 p-p65 表达明显增加（见图3, NPvs.sham, t (df) = 22.36,t(df) = 22.33,P< 0.01）。与溶剂对照组 (NP + Veh) 相比，葛根素 (PU) 明显降低TNF-α 和p-p65 表达（见图3, NP + PUvs.NP + Veh,t(df) = 14.19,t= 30.5,P< 0.01）。

图3 葛根素明显降低NP 移植大鼠DRG 中TNF-α 和p-p65 表达 (n = 4)**P < 0.01，与Sham 组相比，NP 移植（NP 组）大鼠DRG 中TNF-α 和p-p65 表达明显上升；##P < 0.01，与溶剂对照组 (NP + Veh) 相比，葛根素治疗组(NP + PU)组大鼠DRG 中TNF-α 和p-p65 含量明显降低Fig.3 Peurarin significantly decreases TNF-α and p-p65 expression in DRG of rats with NP implantation (n = 4)**P < 0.01, compared with group sham, TNF-α and p-p65 expression in DRG of rats with NP implantation (group NP)are significantly increased; ##P < 0.01, compared with group NP + Veh, in group NP + PU, TNF-α and p-p65 expression in DRG of rats in group NP + PU are significantly decreased.

4.葛根素明显抑制NP 移植大鼠DRG Nav1.7表达，且外源性给予TNF-α 可逆转葛根素的作用

术后14 天，用免疫荧光染色方法检测不同组大鼠手术同侧DRG 中Nav1.7 的表达。与sham 组相比，NP 组Nav1.7 阳性细胞百分比明显增加（见图4A,B, F, NPvs.sham,t= 12.82,P< 0.01）；与溶剂对照组相比，PU 明显降低Nav1.7 荧光阳性面积（见图4C,D, F, NP + PUvs.NP + Veh,t(df) = 4.648,P< 0.01）；给予PU 的同时，鞘内给予大鼠重组TNF-α 可明显增加Nav1.7 阳性细胞百分比（见图4C, E, F, NP + PU +TNF-αvs.NP + PU,t= 9.322,P< 0.01）。表明PU 可通过抑制DRG Nav1.7 上调治疗神经根性疼痛。

图4 葛根素抑制NP 移植鼠DRG Nav1.7 的上调，TNF-α 可阻断其作用 (n = 4)**P < 0.01，与sham 组相比，NP 移植后（NP 组）大鼠DRG 中Nav1.7 表达明显上升(A, B, F)；##P < 0.01，与溶剂对照组 (NP + Veh) 相比，葛根素治疗组(NP + PU)大鼠DRG 中Nav1.7 表达明显降低(C, D, F)；△△P < 0.01，葛根素治疗组(NP + PU)相比，葛根素治疗同时外源性给予TNF-α (NP + PU + TNF)大鼠的DRG 中Nav1.7 表达明显增加(D-F)Fig.4 Peurarin inhibits Nav1.7 upregulation in DRG of rats with NP implantation which is obscured by TNF-α (n = 4)**P < 0.01, compared with group sham, Nav1.7 expression in DRG of rats with NP implantation (group NP) are significantly increased (A, B, F); ##P < 0.01, compared with group NP + Veh, Nav1.7 expression in DRG of rats in group NP +PU are significantly decreased (C, D, F); △△P < 0.01, compared with group NP + PU, co-administration of peurarin and TNF-α (group NP + PU + TNF) significantly increases Nav1.7 expression in DRG (D-F).

讨 论

腰椎间盘突出症是临床常见疾病，主要表现为单侧的，沿着坐骨神经方向的放射性腰疼和腿疼，临床也称为神经根性疼痛[1]。目前临床最常见的治疗手段为手术摘除病变椎间盘。相比药物治疗，手术治疗费用更高，并发症较多，甚至有10%的病人手术摘除病变椎间盘后还出现长期的神经根性疼痛症状，因此深入研究神经根性疼痛产生的机制具有重要临床意义。

外周敏化是慢性疼痛的重要病理生理学机制，是指初级传入神经元上离子通道的表达、运输及功能的改变，进而增加神经元的兴奋性，诱发神经元异常放电，向中枢传递过多的痛觉信号[2,17]。电压门控性钠通道 (VGSCs) 是决定神经元兴奋性最重要的离子通道，神经根性疼痛模型中发现多种亚型的钠通道如Nav1.3、Nav1.6、Nav1.7和 Nav1.8的上调[3,18,19]。Nav1.7 通道失活慢，关闭慢[20]，从而对小而慢的去极化产生一种斜坡电流[21]；Nav1.7 的表达和功能上调可降低痛阈，并对阈下刺激产生过激反应[21]，因此对神经元异常放电的发生至关重要。最近的研究发现Nav1.7 基因SCN9A 的功能丧失型突变是人类先天无痛症发生的重要基础[22]，提示Nav1.7 的功能缺失直接影响伤害性感受器的功能，导致正常痛觉的丧失。既往对神经损伤和高血糖引起慢性疼痛的研究，发现DRG 上致炎细胞因子TNF-α 表达增加是钠通道上调的重要原因[4,5]。因此，我们推断抑制DRG 中的神经炎症反应可能通过下调Nav1.7 缓解神经根性疼痛。

葛根素是从天然植物葛根中提取的一种C-糖基化大豆异黄酮，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用[6～8]，广泛用于治疗心血管系统疾病。近年来实验室研究发现葛根素对神经损伤、高血糖引起的慢性疼痛有治疗作用[6,7,23]。临床研究发现，葛根素配合手法治疗可明显缓解颈椎病病人的疼痛和眩晕症状[24]，葛根素对于老年女性骨质疏松并股骨颈骨折手术病人也具有较好的镇痛作用[25]，葛根素注射液对糖尿病引起的肢体麻木、疼痛及感觉异常有明显缓解作用[8,26]。我们课题组也发现并报道了腹腔注射葛根素可通过抑制脊髓水平的神经炎症反应，抑制小胶质细胞的活化缓解神经根性疼痛[9,10]。在此基础上，我们进一步探究葛根素对DRG 水平的炎症反应的作用，发现连续7 天腹腔注射葛根素可明显降低NP 移植大鼠DRG 及脑脊液中致炎细胞因子TNF-α 含量，并降低下游信号分子p-p65，这表明葛根素对DRG水平的炎症反应同样具有抑制作用。进一步实验发现葛根素可降低NP 移植大鼠神经元上Nav1.7 的表达，且注射葛根素的同时，鞘内给予大鼠重组TNF-α 可明显增加Nav1.7 的表达，因此葛根素可能通过抑制DRG 的神经炎症，下调DRG Nav1.7 的表达，缓解神经根性疼痛。

综上所述，本研究从在体水平证实葛根素可能通过抑制TNF-α/NF-κB 信号通路，降低 DRG 中Nav1.7 的表达，抑制外周敏化，从而治疗神经根性疼痛。不足之处在于缺乏离体实验数据，后续研究可以取DRG 组织进行神经元的原代培养，在细胞水平再次验证葛根素及TNF-α/NF-κB 信号通路对Nav1.7 表达的影响。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。