电针联合推拿对大鼠卒中后认知功能障碍的恢复作用及海马小胶质细胞的参与机制

李子康， 余小江， 万婷， 罗贵聪， 张蕊， 张静

（广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

卒中后认知功能障碍被定义为多个认知领域（如学习、记忆和执行功能）的衰退，这可能长期影响三分之一的中风幸存者[1-2]。联合疗法的概念对于治疗复杂卒中具有重要的指导意义，电针联合推拿因其操作简单易行、副作用少而被广泛应用于临床。本课题组前期临床应用电针联合推拿治疗卒中后认知功能障碍患者，取得了良好的疗效，但其作用机制尚不明确。小胶质细胞在大脑中大量存在，约占总神经胶质细胞的20%[3]。研究[3]表明，小胶质细胞是中枢神经系统的主要常驻免疫细胞，广泛分布于中枢神经系统（CNS）中并参与微环境的调控。小胶质细胞参与几乎所有的脑部疾病，包括神经退行性疾病、创伤性脑损伤和精神疾病等，活化后的小胶质细胞可分泌促炎和抗炎介质，在中枢神经系统损伤过程中发挥重要的作用[4]。因此，本研究建立大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型，观察电针联合推拿对大鼠卒中后认知功能障碍的治疗作用及对海马小胶质细胞的影响，以期为临床治疗卒中提供更多的理论基础，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物无特定病原体（SPF）级成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量250 ～300 g，购自湖北省实验动物研究中心（中国武汉），生产许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。所有动物实验均按照国家卫生研究院和广州中医药大学第一附属医院伦理委员会发布的《实验动物的护理和使用指南》进行。本研究方案已经广州中医药大学第一附属医院伦理委员会审批，动物伦理批号：AEWC-2001461。

1.2 试剂与仪器戊巴比妥钠（美国Merck Millipore公司）；TRIzol试剂、PrimeScript逆转录酶MASTER MIX 试剂盒（日本TaKaRa 公司）。单丝尼龙缝线（L3600，广州嘉陵有限公司）；电针装置（KWD-808 Ⅱ，常州英迪电子医疗器械有限公司）。

1.3 模型建立与分组用1%戊巴比妥钠（200 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，根据Longa等[5]研究构建MCAO模型。具体操作步骤如下：暴露左侧颈总动脉、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）并小心隔离。在远端结扎ECA 后，在ECA 上开一个小切口，将单丝尼龙缝线从ECA切口处插入ICA，直到感觉到轻微的阻力。在2 h 的缺血期后，缓慢移除单丝尼龙缝线以恢复大脑中动脉（MCA）区域的血液供应，实现再灌注。假手术组大鼠给予相同的手术，但不插入单丝尼龙缝线。若观察到大鼠未能伸出右前爪，向右盘旋，甚或向右跌倒则判断造模成功[5]。

分组如下：假手术组、模型组、治疗组，每组6只。假手术组，作为空白对照；模型组大鼠构建MCAO 模型；治疗组大鼠构建MCAO 模型后，给予电针联合推拿治疗。

1.4 电针联合推拿干预电针与推拿在一天的同一时间（大约上午9∶00）先后进行。大鼠被固定在固定装置（在针刺干预前至少3 d，使大鼠适应制动装置）中。采用0.25 mm × 13 mm 一次性无菌不锈钢针插入百会（GV20）和足三里（ST36）[6]。根据华兴邦等发表的“大鼠穴位图谱的研制”[7]确定穴位操作的准确位置。GV20 位于头顶，正中矢状线与两耳尖连线的交点处。ST36 位于膝关节下腓骨头远端5 mm 处，胫骨结节外侧2 mm 处。将两个电极附着在电针治疗组大鼠的头部，使用电针装置对大鼠进行刺激，疏密波频率为2/15 Hz。选择头顶部百会、神庭（GV24，大鼠头前正中线，额顶骨缝交界线前方），腿部足三里，点按法操作每次10 min。术后第1 天开始电针联合推拿治疗，每日1次，连续7 d。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 神经学评分 所有行为学检测均在白天进行，且提前3 d 进行适应性训练，避免大鼠产生焦虑和恐慌，影响实验结果。

（1）滚轴试验（rotard test）：将大鼠首先放置在以4 r/s转动的滚轴上，然后以加速度为0.3 r/s逐渐调整滚轴转速并开始计时，当大鼠掉落滚轴时停止计时，将大鼠从开始加速至掉落滚轴的时间进行记录。每隔1min 检测1 次，共检测5 次，取平均值作为最终试验结果。

（2）网格试验（grid test）：将大鼠首先置于水平金属网格（12 cm × 12 cm，格间距为1 cm）上，待大鼠四脚爪均抓住金属网格后，180°翻转金属网格装置并开始计时，当大鼠四脚爪均掉落网格时停止计时，悬挂时间超过180 s时仅计为180 s。每隔1 min检测1次。共检测5次，取其平均值作为最终试验结果。

1.5.2 莫里斯水迷宫试验 将大鼠置于EthoVision XT Morris 水迷宫视频跟踪测试系统中，该系统可以自动记录大鼠找到平台的时间。该程序如前所述[8]进行。在干预的第40 天，开始为期5 d 的隐藏平台试验。训练时间为60 s，所有动物每天训练2 次。找到平台的时间被记录为逃避潜伏期。大鼠需要人工引导在平台上停留10 s，如果大鼠前5 d没有找到平台，则记录逃避潜伏期为60 s。在第六天，移除平台以测试大鼠的空间搜索能力，随后记录大鼠通过平台最初放置处的频率[9]，计算停留在目标象限的时间百分比和在60 s内首次到达平台区的时间。

1.5.3 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法观察脑梗死面积 使用戊巴比妥钠（800 mg/kg）给予大鼠安乐死，经心脏灌注生理盐水。迅速取出脑，从口侧至尾侧冠状切片，37 ℃避光，采用1%的TTC染色15 min。根据白色梗死区和红紫色非梗死区区分脑组织。按照公式[10]计算：脑梗死面积=[对侧半球面积-（同侧半球面积-梗死面积）/对侧半球面积]×100%。

1.5.4 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测脑组织IL-1β、TNF-α、IFN-γ、CD206、Arg-1、IL-10 mRNA 表达 按照说明书指示，用TRIzol 试剂从各组大鼠脑组织中提取总RNA。用PrimeScript逆转录酶MASTER MIX 试剂盒获得cDNA。PCR 反应条件：94 ℃预变性35 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40个循环。引物扩增长度为100 ～200 bp。用2-ΔΔCT方法[11]进行目的基因定量，以GAPDH 做内参。引物序列如下：IL-1β 上游引物为5’- TCCA GGATGAGGACATGAGCAC-3’，下游引物为5’-GAACGTCACACACCAGCAGGTTA-3’；TNF-α 上游引物为5’-TGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3’，下游引物为5’-GGAGGCCATTTGGGAACT-3’；IFN-γ上游引物为5’-TGAACGCTACACACTGCATCTTG G-3’，下游引物为5’-CGACTCCTTTTCCGCTTCC TGAG-3’；CD206 上游引物为5’-CTTCGGGCCTT TGGAATAAT-3’，下游引物为5’-TAGAAGAGCC CTTGGGTTGA-3’；Arg-1 上游引物为5’- CTTGG CTTGCTTCGGAACTC-3’，下游引物为5’-GGAG AAGGCGTTTGCTTAGTTC-3’；IL-10 上游引物为5’-GGTTGCCAAGCCTTATCGGA-3’，下游引物为5’-ACCTGCTCCACTGCCTTGCT-3’；GAPDH 上游引物为5’-AT GACCACAGTCCATGCCATC-3’，下游引物为5’-GAGCTTCCCGTTCAGCTCTG-3’。

1.6 统计方法采用SPSS 22.0 统计学软件（USA）和Graph prism 8.0软件对数据进行分析和作图，计量资料以均数±标准差（±s）表示，首先进行正态性和方差齐性检验，检验符合正态分布且方差齐，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），事后检验采用Tukey’s多重比较法。P为双侧检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电针联合推拿改善MCAO 模型大鼠脑梗死面积及神经功能为探究电针联合推拿是否能够减轻卒中大鼠脑损伤及恢复神经功能，本研究进行了滚轴试验和网格试验观察其行为学表现，采用TTC染色观察脑梗死面积。结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠滚轴和网格停留时间缩短（均P＜0.01），脑梗死面积增大；与模型组比较，治疗组大鼠滚轴和网格停留时间延长（均P＜0.01），脑梗死面积减小。见图1。上述结果表明，电针联合推拿可有效改善卒中大鼠脑梗死面积及神经功能。

图1 各组大鼠神经学评分、脑梗死面积比较Figure 1 Comparison of neurological scores and cerebral infarct size among various groups of rats

2.2 电针联合推拿改善MCAO 大鼠认知功能障碍为探究电针联合推拿是否可以改善MCAO大鼠的认知功能障碍，本研究进行了莫里斯水迷宫试验，结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠的逃避潜伏期显著延长，穿越平台次数降低，第1次达到平台的时间增加，停留在目标象限的时间比降低（均P＜0.01）；与模型组比较，治疗组大鼠的逃避潜伏期显著缩短，穿越平台次数升高，第1次达到平台的时间减少，停留在目标象限的时间比升高（均P＜0.01）。见图2。上述结果表明，电针联合推拿可有效改善MCAO 大鼠的认知功能障碍。2.3 电针联合推拿促进MCAO 大鼠海马小胶质细胞M2 极化为了探究电针联合推拿是否对MCAO大鼠海马小胶质细胞产生了影响，本研究通过qRT-PCR 法检测了各组大鼠小胶质细胞中M1、M2 极化标志物的mRNA 表达变化，结果显示：模型组大鼠海马小胶质细胞M1 极化标志物（IL-1β、TNF-α、IFN-γ）表达较假手术组升高（均P＜0.01），而M2 极化标志物（CD206、Arg-1、IL-10）表达较假手术组降低（均P＜0.01）；治疗组大鼠海马小胶质细胞M1 极化标志物表达较模型组降低（均P＜0.01），而M2 极化标志物表达较模型组升高（均P＜0.01）。见图3。以上结果表明，电针联合推拿可促进MCAO 大鼠海马小胶质细胞从M1 极化向M2极化发展。

图2 各组大鼠认知功能比较（莫里斯水迷宫试验）Figure 2 Comparison of cognitive function among various groups of rats（Morris water maze test）

图3 各组大鼠小胶质细胞M1、M2极化标志物mRNA表达比较Figure 3 Comparison of mRNA expressions of M1 and M2 polarization markers in microglial cells among various groups of rats

3 讨论

卒中后认知功能障碍归属于中医学“善忘”“呆痴”“神呆”“愚痴”“呆病”等范畴，病位主要在脑，脏腑虚衰以致痰瘀内生、痹阻脑窍是本病发生、发展的共性机制，开窍醒神、健脾通络为主要治法。百会和足三里是中医临床治疗中风最常用的穴位。百会属于督脉，具有清头散风、开窍醒神之功效。足三里属于胃经，具有健脾和胃、益气补虚、通络除痹的功效。两穴同用具有补中益气、安神定志、调节阴阳之效，研究表明，电针百会、足三里穴可以通过多种途径和环节减轻中风后炎症损伤，减少脑梗死体积，促进神经功能恢复[12-16]。而推拿可以改善组织灌注、信号转导、细胞应激和炎症[17-18]，有助于机械刺激后运动/神经肌肉系统重塑[19-20]。神庭穴属于督脉，具有清头散风、镇静安神之功效，主治头痛、眩晕、癫狂痫、失眠、健忘等证。本研究应用电针百会穴、足三里穴联合点按百会、神庭、足三里穴治疗MCAO 模型大鼠，神经学评分结果表明，MCAO模型大鼠的运动和感觉协调性降低，而电针联合推拿可在一定程度上改善这种情况。本研究进一步通过TTC 染色法观察了MCAO 大鼠大脑梗死情况，其结果与神经学评分结果相一致，MCAO模型大鼠脑梗死面积显著增加，而电针联合推拿可减轻大鼠脑梗死，表明MCAO 大鼠接受电针联合推拿治疗后，运动协调性、认知功能及脑梗死情况均得到显著改善。

小胶质细胞是具有高度可塑性的细胞，对改变其环境的刺激反应多样[21-22]。小胶质细胞的激活被定义为经典激活（M1）和选择性激活（M2）表型[23]，M1 小胶质细胞可释放促炎细胞因子破坏神经元，相反，M2 小胶质细胞可分泌神经保护介质和营养因子[24]。有研究揭示了缺血性卒中后梗死周围区域存在M2-M1 小胶质细胞表型的转变[25]。这种小胶质细胞表型转化亦在脊髓损伤模型中报道[26]。提示小胶质细胞的表型改变可能是多种中枢神经系统损伤的共同病理机制。小胶质细胞的M1/M2极化主要通过M1（例如IL-1β、TNF-α、IFN-γ）和M2（例如CD206、IGF-1、TGF-β、Arg-1、IL-10）相关基因的表达来分类[27-29]。M2 小胶质细胞可吞噬受损的神经细胞碎片，抑制过度的炎症反应，促进组织修复和神经元再生，防止继发性炎症损伤，并维持正常的中枢神经系统微环境[30]。维持小胶质细胞的M2 表型，同时抑制M1 小胶质细胞的极化，对于减轻缺血性卒中后脑损伤具有很大的潜力。Lu 等[31]通过观察小鼠大脑内小胶质细胞M1、M2 极化标志物发现，米诺环素促进动脉闭塞-再灌注（MCAO/R）小鼠小胶质细胞M2极化，抑制M1 极化，可使神经元存活和神经功能恢复。本研究结果显示，MCAO大鼠接受电针联合推拿治疗后，脑组织M1极化标志物IL-1β、TNF-α、IFN-γ mRNA 表达显著减弱，M2 极化标志物CD206、Arg-1、IL-10 mRNA 表达显著增强，提示MCAO大鼠海马小胶质细胞的极性由M1 转变到了M2，表明联合治疗在一定程度上促进了MCAO 大鼠脑组织抗炎反应。

综上所述，电针联合推拿可通过介导小胶质细胞M2 极化改善大鼠卒中后认知功能障碍，但调控小胶质细胞极化过程复杂，具体的分子调控机制有待进一步深入研究。