水杨酸在白桦苗期抵御盐碱胁迫中的调控作用

王景哲 牛朝奎 梁馨元 申晨静 尹 静，2*

（1.东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040；2.东北林业大学东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040）

土地盐碱化已经成为全球范围内普遍存在的环境问题，严重威胁了农林业的可持续发展以及未来的粮食安全［1］。研究表明，土壤盐碱化会降低植物吸收水分和养分的能力，造成植物细胞代谢及生理功能紊乱，具体表现有缺水性应激、离子毒害、膜脂过氧化、光合系统损伤以及营养缺乏等，严重抑制了植物的生长，加速其衰老死亡进程［2］。

目前土地盐碱化问题严重影响了白桦（Betula platyphylla）种植面积的扩大，限制了白桦树种的应用。白桦为桦木科（Betulaceae）桦木属（Betula）落叶乔木，广泛分布于我国13 个省区［3］。白桦用途广泛，又因适应性强、成活率高、抗病虫害能力强等优点，具有良好的应用前景［4］。白桦叶和外皮中的白桦酯醇类三萜及黄酮等成分具有保护植物抵御胁迫的抗逆功能［5-7］，这些次生代谢产物含量及其相关途径基因的表达显著受环境因素（光照、营养、温度）及激素（乙烯、ABA、SA、JA）等影响［8-10］，在抵御逆境过程中发挥重要作用。

研究盐碱胁迫对白桦生长发育的影响以及如何提高白桦的耐盐碱性具有十分重要的理论意义和应用价值。水杨酸（salicylic acid，SA）是一种重要的内源植物激素，在植物抵御病原体感染以及非生物胁迫（高盐、干旱、高温、低温、水淹）等方面起着关键作用［11-12］。大量研究表明，外源施加一定浓度的SA 可以通过提高植物抗氧化酶活性、增加渗透物质及次生产物（萜类、黄酮、生物碱等）含量、增强植物光合作用及呼吸作用、诱导与植物抗性相关基因的表达等方式，有效减轻盐胁迫对植物造成的伤害［13-14］。关于SA 提高植物耐盐性的相关研究在甘草（Glycyrrhiza uralensis）［13］、月季（Rosa chinensis）［15］、高粱（Sorghum bicolor）［16］、棉花（Gos-sypiumspp.）［17］、白榆（Ulmus pumila）［18］等多种植物中均已证实，但植物响应外源SA 信号抵御胁迫的具体机制具有一定的复杂性，沙汉景等［19］综述了SA调控植物耐盐性的生理机制，并表明外源SA在不同胁迫强度、植物种类、发育阶段、处理浓度及方式、喷施时期及次数等方面具有不同的作用。Yin 等［20-22］研究也表明，适宜浓度SA 及MeJA（茉莉酸甲酯）可以提高白桦细胞及植株中抗逆酶活性、三萜物质含量积累、三萜合成途径中FPS、SS等关键基因的表达，其主要机制是SA 可以诱导相关的bHLH 及MYB 类转录因子的表达，从而启动下游相关抗逆基因及次生产物合成途径基因的表达。目前国内关于利用相关抗逆基因提高白桦耐盐碱特性的研究也有陆续报道，LEA 蛋白（late embryogenesis abundant proteins）是一类胚胎发育晚期种子中大量富集的蛋白，在植物抗逆过程中起重要作用，从白桦全基因组序列中鉴定出13 个与拟南芥（Arabidopsis thaliana）抗逆LEA基因同源的白桦LEA基因，并分析了13 个LEA基因对盐胁迫（100 mmol·L-1NaCl）的表达响应［23］；植物年龄响应因子miR156 基因过表达白桦株系与对照株系相比，在一定程度上降低了白桦的耐盐性（0.4% NaCl）［24］；GRAS 转录因子基因BpPAT1、BpGRAS1可以提高白桦耐盐能力［25-26］。上述研究报道主要集中在白桦耐盐基因表达及功能鉴定方面［23-26］，而针对外源施加信号分子调控白桦耐盐性的研究报道较少。因此，本研究以白桦幼苗为材料，以碱性盐NaHCO3溶液模拟盐碱胁迫环境，同时通过外施SA 信号，重点从生理响应、三萜途径基因表达、次生代谢产物的角度探究SA 在白桦抗盐碱胁迫过程中的调节功能，为进一步揭示白桦耐盐碱机制及其指导生产应用方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

白桦种子为东北林业大学林学院刘桂丰教授惠赠，来自校内白桦种子园树龄30 a 左右的优良单株白桦。

1.2 处理方法

采用盆栽法培养白桦幼苗，2021 年6 月将种子播种于口径为10 cm、高15 cm的培养钵中，盆栽用土为V（黑土）∶V（蛭石）=3∶1，在东北林业大学生命科学学院温室内培养3个月后，选取长势一致的白桦幼苗随机分为3 组，每组约50 株，分别施加清水处理（CK），盐碱胁迫处理（T1），盐碱胁迫+水杨酸处理（T2）。盐碱胁迫处理方法具体为，在培养钵所在托盘中加入1 L（足够饱和土壤的用量）的200 mmol·L-1NaHCO3溶液（CK 以等体积清水代替），吸收处理1h，直至土壤充分吸取溶液达到饱和，后将托盘中的盐碱溶液弃去，取样测定期间不再补充水分。T2 组在倒入NaHCO3后，用360 µmol·L-1SA 溶液对叶片进行均匀喷施处理。本试验中白桦幼苗处理所用的SA 浓度由实验室前期筛选明确［27］。

1.3 取样及测定指标

1.3.1 抗逆生理指标测定

在处理后第1、2、3、5、7 天分别取3 组条件下的白桦苗中部叶片进行相对电导率（relative conductivity，REC）测定，其余所取叶片液氮速冻，低温保存（-20℃），测定脯氨酸含量、可溶性糖含量（soluble sugar，SSC）、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、过氧化物酶（peroxidase，POD）活性、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性。相对电导率测定参考郝再彬等［28］的方法，脯氨酸测定采用酸性茚三酮显色法［29］，可溶性糖测定采用蒽酮比色法［29］，可溶性蛋白测定采用考马斯亮蓝法［30］，SOD、POD 的测定分别参考萧浪涛等［29］、李合生［31］的方法，CAT、APX的测定参考陈建勋等［32］的方法。

1.3.2 叶绿素荧光参数测定

不同处理后第7天分别取各组大小一致、生长旺盛的白桦苗中部叶片利用FluorCam 叶绿素荧光成像仪（FC 800-O，捷克）进行叶绿素荧光参数的测定。

1.3.3 次生产物含量测定

不同处理6 h、12 h、24 h、7 d 后分别取各组白桦苗整株（每组3株）进行总三萜、黄酮及多酚的提取与测定，总三萜、黄酮的测定具体参考李可鑫等［9］的方法。多酚测定方法如下：准确称取样品0.1 g 于10 mL 离 心 管 中，加 入3.5 mL 体 积 分 数60%乙醇，70 ℃水浴提取1 h后超声1 h，重复2次，过滤，合并滤液，将滤液离心（10 000 r·min-1，5 min）。准确吸取0.1 mL 的上清液，加入10% Folin-phenol试剂0.5 mL，然后加入7.5%饱和碳酸钠溶液1.4 mL，再次混匀后，在避光室温（25 ℃）条件下反应30 min，测定吸光度。设定空白对照，3次重复。

1.3.4 基因相对表达测定

不同处理6、12、24 h 后分别取各组白桦苗中部叶片，液氮速冻，超低温保存（-80 ℃），采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）反应，测定三萜合成途径关键基因HMGR、FPS、SS、SE、BPX、BPW相对表达量。以白桦微管蛋白基因为内参，CTAB 法提取RNA，以消化DNA 后的1 µg RNA 为模板，合成不同处理条件的cDNA 模板，进行定量RT-PCR 检测（qRT-PCR）。qRT-PCR 反应体系：10.0 µL Master Mix，1.0 µL cDNA模板，正反向引物各0.4 µL，用双蒸水补足至20.0 µL。扩增反应利用Applied Biosystems 7500荧光定量PCR 仪（ABI 7500，美国）进行，反应程序：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s（共40 个循环），95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。3 次重复，目标基因表达水平用相对定量的2-ΔΔCt法计算。试验涉及三萜合成途径关键基因HMGR、FPS、SS、SE、BPX、BPW的real-time PCR 引物均来自东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室之前的设计［33-34］。

1.4 数据处理

用Microsoft Excel 2021及GraphPad Prism 8.0.2整理实验数据并作图，利用SPSS 软件进行数据分析，采用最小显著性差异法分析各处理间差异。

2 结果与分析

2.1 外源SA对盐碱胁迫下白桦苗耐盐性的影响

2.1.1 相对电导率及叶绿素荧光参数（Fv/Fm）

如图1A 所示，盐碱胁迫下，T1 与T2 组的叶片相对电导率均随时间推移呈先增后减的变化，并在第2天达到最大值，显著大于CK组（P＜0.05），分别约为CK的6倍和5倍；总体上施加SA的T2组REC基本小于T1组，说明SA能够缓解盐碱胁迫对白桦苗膜系统的损伤，减少了胞内电解质的大量外渗。

图1 不同处理组白桦苗叶片相对电导率和叶绿素荧光参数Fv/FmT1.200 mmol·L-1 NaHCO3 处 理；T2.200 mmol·L-1 NaHCO3+360 µmo·lL-1 SA处理；不同字母表示差异达到显著水平（P＜0.05）；下同Fig.1 Relative electrical conductivity and Chlorophyll fluorescence parameters Fv/Fm of leaves of birch seedlings indifferent treatment groupsT1.Represented for 200 mmol·L-1 NaHCO3；T2.Represented for 200 mmo·lL-1 NaHCO3+360 µmo·lL-1 SA；Different letters indicated that the difference reached a significant leve（lP＜0.05）；The same as below

与CK 组相比，盐碱胁迫后的T1 组幼苗Fv/Fm显著下降（P＜0.05），而外施SA 的T2 组幼苗Fv/Fm相对于CK 组下降程度较小，高于T1组（图1A），说明在盐碱胁迫下外施SA 一定程度上能够保护白桦苗叶片的光合系统。

2.1.2 渗透平衡调节

盐碱胁迫下，T1 组脯氨酸含量在胁迫的第1、2 天高于CK 组，之后呈下降趋势，到第7 天远低于CK 及T2 组，而T2 组脯氨酸含量均高于T1 组，且在胁迫第1 天达到最大值，显著高于CK 及T1 组（P＜0.05）（图2B）。不同处理组可溶性蛋白含量呈先升后降的趋势，T1 组在胁迫第2 天达到最大值，T2 组蛋白质含量在胁迫3～5 d 保持较高水平，第3天达到最大值，显著高于CK 及T1 组（P＜0.05）（图2A）。3 组白桦苗叶片的可溶性糖（SSC）含量变化（图2C）表明，T1 组SSC 含量呈先增后降的趋势，在第2 天达到最大值，为CK 对照的3.5 倍，T2 组的2.6 倍。外施SA 的T2 组SSC 含量在胁迫第1 天迅速升高达到最大值，相比于CK 增加了66%，相比于T1 组增加了25%，而在第2 天迅速下降，之后趋于平稳，结合T2组可溶性蛋白含量变化推测SA可能促进可溶性糖向蛋白质转化，增加营养物质，增强代谢活动以更好地应对逆境。

图2 不同处理组白桦苗叶片渗透物质含量Fig.2 Content of osmotic substance in leaaves of birch seedlings in different treatment groups

2.1.3 抗氧化酶活性

如图3A 所示，T2 组SOD 酶活性在胁迫第1 天明显高于T1 组（P＜0.05），其余时间点与T1 组并无明显差异，在取样后期稍高于T1组。T1组POD 酶活在胁迫第1 天明显高于T2 组（P＜0.05），而T2 组POD 酶活性在胁迫第5 天明显高于T1 组（P＜0.05），在其余时间点两者差异不显著（图3B）。T1组CAT 酶活性随时间先增后减，在第3 天达到最大值，约为CK 组的2.2 倍，而外施SA 的T2 组CAT酶活性同样随时间先升后降，在第3 天达到最大值，且T2 组不同取样时间的CAT 活性基本均大于T1 组，在第2 天差异明显，约为T1 组的2 倍（图3C）。3 组白桦苗叶片不同取样时间的APX 酶活性差异并不显著，而T1 组APX 酶活性基本均小于CK组，T2组APX活性基本均大于T1组（图3D）。

图3 不同处理组白桦苗抗氧化酶活性Fig.3 Antioxidant enzyme activities of birch seedlings in different treatment groups

盐碱胁迫处理的T1组SOD 酶活性在第1天内下降至较低水平随后逐步上升，而POD 酶活性在第1天内上升到较高水平随后逐渐下降，说明两者存在一定的互相补充效应，T1 组SOD、POD、APX的酶活性总体上都低于CK 对照，可能是由于盐碱浓度过高，一定程度上减弱了其抗氧化能力。而外施SA的T2组的SOD、POD酶活性虽总体上也小于CK 对照，但在取样后期趋势明显上升，高于T1组，T2组的CAT、APX 活性在胁迫后均处于较高水平，基本高于CK 对照，这也进一步说明外施SA 能够通过增强抗氧化酶活性来缓解盐碱胁迫下白桦苗叶片脂膜过氧化，并在不同酶的协调作用下，共同起到保护白桦苗的作用。

2.2 外源SA 对盐碱胁迫下白桦苗次生代谢产物合成的影响

2.2.1 三萜合成途径关键基因相对表达量

图4 结果显示，2 处理组HMGR基因相对表达量在6、12 h 变化不显著，但24 h 盐碱胁迫下施加SA 的T1 组HMGR表达量大幅度增加。FPS、SE对盐碱胁迫敏感，并在24 h 内表达量增加，而对于外施SA的T2组6、24 h时表达量不高，在12 h时表达量大幅度增加。BPX、SS、BPW对盐碱胁迫敏感，而对于施加SA的盐碱处理相对不敏感，T1组在6～24 hBPX相对表达量呈先减再增的趋势，BPW表达量逐步增加，到24 h 显著增加达到最大值，约为T2 组的50 倍，SS表达量降低，到24 h 大幅度降低至较低水平；T2组在6～24 h内，BPX相对表达量仅在12 h时显著增大，SS表达量降低，BPW表达量变化不显著。

图4 不同处理组三萜合成途径关键基因的相对表达量Fig.4 Relative expression of key genes of triterpenoid synthesis pathway in different treatment groups

结果显示，在盐碱胁迫下外施SA后，FPS、SE、BPX3个基因总体上均在12 h时表达量显著增加，HMGR、BPW表达量在6～24 h 逐步增加，在24 h 时表达量达到最大，而SS基因表达量呈逐步降低趋势。

2.2.2 次生代谢产物含量

如图5 显示，在胁迫初期6～12 h 内，T1、T2 组总三萜积累量低于CK，12 h 后，T1 组呈上升趋势，T2 组先降后升，第7 天达到最大值，高出T1 组34%，高出CK 组47%。T1、T2 组在胁迫后6 h 时黄酮含量均低于CK 组，并在12 h 后逐渐上升，T1 组较T2 组增幅明显，第7 天达到最大值，比CK 高20%，高出T2 组31%。T1 组多酚含量较为稳定，且均处于较高水平，T2组多酚含量波动较大，在6 h时显著低于CK、T1 组（P＜0.05），在胁迫第7 天3 组白桦苗的多酚含量差异并不显著。

图5 不同处理组白桦苗次生代谢产物质量分数Fig.5 Content of secondary metabolites in birch seedlings in different treatment groups

3 讨论与结论

当植物遭受盐碱胁迫时，植物自身会启动防御措施，如增加渗透物质含量调节渗透平衡、选择性吸收/外排离子以维持离子平衡、增强光合和呼吸作用、提高抗逆酶活性、激素相互应答、激活抗逆基因等［35］。盐碱胁迫后植物体中往往产生大量活性氧，它们能够引起蛋白失活、DNA 链断裂和膜脂过氧化等现象，对细胞造成毒性，破坏细胞结构［36］。相对电导率是反映植物膜系统状况的一个重要的生理生化指标，Fv/Fm比值大小反映植物叶片光系统Ⅱ（PSⅡ）效率。本研究发现，盐碱胁迫使得白桦苗叶片膜系统遭到破坏，降低了光合效率，而外施SA 一定程度上保护了白桦苗叶片膜系统，减少了胞内电解质的大量外渗，并且提高了白桦苗叶片的Fv/Fm值，缓解了植株遭受的光抑制。本研究结果表明，SA 能够缓解盐碱胁迫对白桦苗膜系统的损伤，增加渗透调节物质脯氨酸以及营养物质可溶性蛋白含量，帮助白桦苗抵御盐碱胁迫。已有研究表明外施SA 能够增强植物盐胁迫下的抗氧化酶活性，但促进作用存在差异，这主要是由于植物种类不同，盐胁迫的浓度及时长不同，外施SA 的处理部位、方式及浓度的不同等［19］。本研究结果显示，在盐碱胁迫下，外施SA 有利于提高白桦苗叶片的CAT、APX 活性，而对于SOD、POD 来说有一定的延迟效应，主要在取样后期促进SOD、POD 酶活性提高。另外发现，不同抗氧化酶之间存在互相补充效应，以抵御盐碱胁迫。

白桦三萜、黄酮等次生代谢产物具有广泛的药用价值，而多酚作为一种重要的植物次生代谢物质，能够清除植物体内自由基，帮助植物抵御逆境［37］。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶（HMGR）是萜类合成的甲羟戊酸途径中的第一个限速酶，另外，法尼基焦磷酸合酶（FPS）、角鲨烯合酶（SS）、角鲨烯环氧酶（SE）、羽扇醇合酶（BPW）、环阿齐醇合酶（BPX）均参与白桦三萜的合成途径。有研究表明，在植物遭受胁迫时，会上调自身次生产物合成基因的表达，促进次生产物的合成以缓解伤害［38-39］。SA 在白桦次生代谢产物的合成方面是重要的诱导信号［27］。本研究结果显示，在盐碱胁迫初期12 h 内，白桦苗合成总三萜、黄酮的代谢途径可能受到抑制，但盐碱胁迫处理促使三萜合成途径关键基因表达上调，且总三萜、黄酮含量逐渐上升，说明随着时间的延长，盐碱胁迫在一定程度上又促进了总三萜、黄酮的产生来应对盐碱胁迫。同时发现，SA 在诱导HMGR、FPS、SE、BPX基因上调较为显著，但盐碱信号的作用增加了SA 诱导白桦苗次生产物合成的复杂性，HMGR酶是萜类代谢途径中的重要调控位点，T2 组HMGR基因在24 h 时显著上调，但诱导BPW、SS上调并不显著，总三萜在第7天积累较多且含量明显升高，黄酮含量在胁迫期间基本处于较高水平，这可能与逆境下H2O2参与介导SA 诱导白桦细胞次生代谢产物合成途径的基因表达直接相关［40］。

综上，本研究表明200 mmol·L-1NaHCO3处理下，360 µmol·L-1SA 喷施处理能够通过调节白桦幼苗渗透平衡、增强抗氧化防御系统、缓解光抑制、调控次生产物含量来提高白桦幼苗的耐盐碱性。同时发现，NaHCO3胁迫使得白桦苗三萜合成途径关键基因FPS、SS、SE、BPX、BPW的表达上调，并在胁迫前期显著促进了白桦苗多酚的合成，在胁迫后期显著促进了总三萜、黄酮物质的积累；盐碱胁迫后，外施SA 可进一步促进白桦苗中HMGR、FPS、SE、BPX基因表达，在胁迫过程中显著提高了总三萜、黄酮物质的积累，这可能是SA提高白桦耐盐碱特性的原因之一。