马蔺幼胚高效再生体系的建立

安文杰 王银杰 刘清泉 杨永恒 张 婷 范少茹 张永侠* 原海燕

（1.山西林业职业技术学院，太原 030009；2.江苏省中国科学院植物研究所，南京 210014）

马蔺（Iris lactealvar.chinensis）为鸢尾科（Iridaceae）鸢尾属（Iris）多年生草本植物，又名马莲、兰花草，原产我国，广泛分布于全国各地。马蔺的花、种子和根均可入药［1］，叶子干枯后，营养成分高，是优质饲草，还可作为造纸原料［2］。马蔺具有抗旱、耐盐碱、耐践踏、抗病等特点，因此水土保持能力强、养护成本低，在城市园林地被及干旱盐碱地区生态治理中具有广阔的应用空间［3-6］。

作为园林地被植物，马蔺花色较为单一，花色仅有白色、浅蓝色、蓝色或蓝紫色。因此，若能培育出花色丰富的马蔺新种质对于提升马蔺景观价值和推动马蔺的推广应用具有重要意义。鸢尾属植物大多种间杂交不育，很难通过常规杂交途径获得马蔺新种质，而分子育种是获得新种质的有效途径，但稳定高效的再生体系是分子育种的基础。目前关于马蔺高效再生体系的报道尚少，孟林等以马蔺种子为外植体，愈伤组织诱导率仅58%［7］；刘孟颖等以马蔺不定芽为外植体，一年仅繁殖5.29 个后代，繁殖率低［8］。研究发现，种子胚更易获得胚性愈伤组织［9-10］，且幼胚愈伤诱导率比成熟胚更高，污染率和褐化率更低［11］。

综上，本研究以马蔺幼胚为试验材料，从不同时期幼胚及不同植物生长调节剂对愈伤组织、体胚和不定芽诱导影响等方面探究马蔺高频离体再生体系建立的有效技术和方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2020年4～5月，取马蔺授粉后的幼胚为外植体，马蔺于1994年引自黑龙江森林植物园，花蓝紫色。

1.2 外植体制备及消毒

取回的蒴果经10%的家用洗洁精浸泡10 min后，流水冲洗0.5～1.0 h，然后置于超净工作台，75%乙醇消毒5 min，无菌水清洗2 次后备用。蒴果用解剖刀剖开，取出种子，将种子置于解剖台上，解剖针挑破萌发孔后，用镊子轻轻挤出幼胚。

1.3 不同时期的幼胚对愈伤组织诱导的影响

取马蔺人工授粉10、15、20、25、30、35、40、45 d后的幼胚分别接种到含1.0 mg·L-12，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和0.2 mg·L-16-苄氨基嘌呤（6-BA）的MS 培养基中，每瓶接种20 个外植体，在（25±2）℃的黑暗条件下培养。共8 个处理，每个处理3 次重复。

1.4 愈伤组织诱导

取出的幼胚接种于愈伤组织诱导培养基中，在（25±2）℃黑暗条件下培养。诱导培养基为添加2，4-D（0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1）和6-BA（0.1、0.2、0.5 mg·L-1）的MS 培养基，处理为：C1（0.5 mg·L-12，4-D+0.1 mg·L-16-BA）、C2（1.0 mg·L-12，4-D+0.2 mg·L-16-BA）、C3（1.0 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-16-BA）、C4（1.5 mg·L-12，4-D+0.2 mg·L-16-BA）、C5（1.5 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-16-BA）、C6（2.0 mg·L-12，4-D+0.2 mg·L-16-BA）、C7（2.0 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-16-BA），蔗糖质量浓度为30 g·L-1，琼脂粉为6 g·L-1，pH=5.8，共7 个处理。根据愈伤组织诱导率确定最佳外植体愈伤组织诱导培养基。愈伤组织诱导率=诱导获得愈伤组织的外植体数/接种的外植体总数量×100%。每个处理30 个外植体，3次重复。

1.5 体胚诱导

获得的愈伤组织分切成直径约5 mm 的小块后转移至体胚诱导培养基，在（25±2）℃黑暗条件下 培 养。诱 导 培 养 基 为 添 加2，4-D（0、0.25、0.50 mg·L-1）和6-BA（0、0.05、0.10 mg·L-1）的MS 培养基，处理为：T1（不添加激素）、T2（0.25 mg·L-12，4-D+0.05 mg·L-16-BA）、T3（0.50 mg·L-12，4-D+0.10 mg·L-16-BA），蔗糖质量浓度为30 g·L-1，琼脂粉为6 g·L-1，pH=5.8，共3个处理。体胚诱导率=诱导的体胚数量/接种的愈伤组织数量×100%。每个处理20个胚性愈伤组织块，重复3次。

1.6 不定芽诱导

带有体胚的胚性愈伤组织接种到分化培养基中，在（25±2）℃，光照强度54 µmol·m-2·s-1，14 h 光照/10 h黑暗的光周期条件下培养。分化诱导培养基为添加噻苯隆（TDZ，0.5、1.0、1.5 mg·L-1）或6-BA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1）和NAA（0.1、0.2 mg·L-1）的MS培养基，处理为：S1（0.50 mg·L-1TDZ+0.10 mg·L-1NAA）、S2（1.00 mg·L-1TDZ+0.20 mg·L-1NAA）、S3（1.50 mg·L-1TDZ+0.20 mg·L-1NAA）、S4（0.50 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA）、S5（1.00 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA）、S6（1.50 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA），蔗糖质量浓度为30 g·L-1，琼脂粉为6 g·L-1，pH=5.8，共6 个处理。观察统计愈伤组织的分化率，愈伤组织的分化率=分化的胚性愈伤组织数量/检测的胚性愈伤组织总数量×100%。每个处理20个胚性愈伤组织块，重复3次。

得到的不定芽分为带3～4 个芽的小芽丛接种到上述分化培养基上，每个处理20个不定芽丛，进行3 次继代，每30 d 继代一次。观察生长情况，统计增殖系数=增殖不定芽数量/接种不定芽数量。

1.7 生根诱导和驯化移栽

不定芽长至3～5 cm，接种到生根培养基，生根培养基由MS 添加NAA（0、0.1、0.2、0.5 mg·L-1），和30 g·L-1蔗糖（pH=5.8）组成。观察不定芽的生根率及生根的状态。生根率=生根的不定芽数量/检测的不定芽总数量×100%。每个处理30 个不定芽，重复3次。再生植株生根后从培养瓶中取出小植株，用自来水洗净根部的培养基。将再生植株移栽至温室中炼苗2～3 d。栽培基质为高压灭菌后的蛭石。4周后观察植株生长状况并统计成活率。

2 结果与分析

2.1 不同时期幼胚对愈伤组织诱导的影响

马蔺人工授粉后15 d 时，种子形成，胚乳水渍状，很难观察到幼胚。随着幼胚发育到30 d，能看到明显的幼胚，幼胚透明状略带白色；幼胚发育到35 d 时（见图1A），幼胚乳白色，胚乳柔软，幼胚剥取容易；当幼胚发育到45 d 时，胚乳硬化，幼胚剥取时易受损伤。因此，最佳的幼胚剥取时间为人工授粉后35～45 d。

2.2 胚性愈伤组织诱导

由表1 可以看出，随着2，4-D 质量浓度的增大，愈伤组织的诱导率提高，形成愈伤组织的时间逐渐缩短。除2，4-D 质量浓度为0.5 mg·L-1时，诱导出愈伤组织的时间较长，为20 d，其他2，4-D 质量浓度诱导时间均在10 d 左右。2，4-D 质量浓度大于1.0 mg·L-1时，愈伤组织的诱导率均高于75 %；2，4-D质量浓度小于1.0 mg·L-1时，诱导出的愈伤组织为浅黄色，致密颗粒型的胚性愈伤组织（见图1B）；2，4-D质量浓度大于1.0 mg·L-1时，诱导出的愈伤组织淡黄色、透明、质地松软或黄色的大颗粒状，为非胚性愈伤组织。因此，最适的马蔺愈伤组织诱导培养基为MS+1.0 mg·L-12，4-D+0.2 mg·L-16-BA。

表1 不同植物生长调节剂对马蔺幼胚愈伤组织的影响Table 1 Effects of plant growth regulators（PGRs）on the proliferation of callus from immature embryo of I.lacteal var.chinensis

2.3 体胚的形成

诱导出的愈伤组织在最适诱导培养基上继代2～3 次后（见图1C），胚性愈伤组织切分为3～5 mm左右的小块转接到体胚诱导培养基上。由图1 和表2 可以看出，将胚性愈伤组织转接到不含2，4-D或含有少量2，4-D 的培养基上，可以诱导出体胚，诱导培养4周后可明显看到有凸起的白色圆形或棒状体胚（见图1D）。当2，4-D质量浓度为0.25 mg·L-1时，体胚的诱导效果最好，诱导率达到71.67%。

图1 马蔺胚性愈伤组织诱导、增殖和植株再生A.授粉30 d后剥出的幼胚；B.幼胚诱导出的胚性愈伤组织（30 d）；C.胚性愈伤组织增殖；D.胚性愈伤组织分化形成体细胞胚；E.体胚或胚性愈伤分化形成不定芽；F，G.不定芽的生根（14、42 d的生根苗）；H.移栽42 d后的完整植株Fig.1 Induction， proliferation of embryogenic calli of I.lacteal var. chinensis and plant regenerationA.Immature embryos peeled after 30 d of pollination；B.Embryogenic calli induced by immature embryo；C.Proliferation of embryogenic calli；D.Embryogenic calli differentiate into somatic embryos；E.Somatic embryos or embryogenic calli differentiate into adventitious buds；F，G.Rooting of adventitious buds（rooting seedlings at 14 and 42 d）；H.Complete plants after 42 d of transplanting

表2 不同植物生长调节剂对马蔺体细胞胚诱导的影响Table 2 Effects of plant growth regulators（PGRs）on the induction of somatic embryos of I.lacteal var.chinensis

2.4 不定芽诱导及增殖

不同植物生长调节剂浓度配比对马蔺不定芽诱导及增殖效果影响较大（见表3），将带有体胚的胚性愈伤组织转接到分化培养基上，4周后分化出不定芽（见图1E），添加TDZ质量浓度为1.0 mg·L-1，不定芽的诱导率最高，达78.33%，且不定芽的长势好；TDZ 质量浓度高于1.0 mg·L-1，不定芽的分化率显著降低，且部分不定芽发生玻璃化；不同质量浓度的6-BA 对不定芽诱导率均低于TDZ，且部分胚性愈伤或体胚变绿但不能分化出不定芽。同样，添加TDZ 的培养基上不定芽增殖系数高于添加6-BA 的培养基，且TDZ 质量浓度为1.0 mg·L-1时，增殖系数最高，为3.65。因此，最佳的分化及增殖培养基均为MS+1.0mg·L-1TDZ+0.2 mg·L-1NAA。

表3 不同植物生长调节剂对马蔺不定芽诱导率及增殖的影响Table 3 Effects of different plant growth regulators（PGRs）on adventitious buds and the proliferation of adventitious buds of I.lacteal var. chinensis

2.5 生根培养与驯化移栽

不定芽在添加不同质量浓度NAA 的MS 培养基中诱导生根，2 周后有不定根形成（见图1F），4周后的生根率均达到100 %，根的生长速度很快，到8 周左右根几乎长满了培养瓶底部（见图1G）。不添加NAA 的MS 培养基诱导出的根细弱，数量少；添加少量NAA（＜0.2 mg·L-1）的MS 培养基，诱导出的根数量多、柔软且生长健壮；添加高质量浓度NAA（＞0.5 mg·L-1）的MS 培养基，诱导出的根数量过多、粗短、质硬且易断（见表4）。

表4 植物生长调节剂对马蔺不定芽生根的影响Table 4 Effects of different plant growth regulators（PGRs）on rooting of I.lacteal var. chinensis

生根4 周后的马蔺植株开盖炼苗后洗去培养基移栽至高压灭菌后的蛭石基质中，移栽后置于光照培养箱中，温度20～25 ℃，4 周后成活率95%以上（见图1H）。

3 讨论

植物组织培养通常选择植物细胞分裂最旺盛的幼嫩组织为外植体，如幼胚、茎尖、幼嫩花器官、嫩叶等［12-14］，鸢尾属植物属于基生叶，茎尖埋于土层内，因此存在消毒困难，污染严重等问题［15］，幼嫩花器官作为外植体存在诱导率低，诱导周期长等缺点［16］。马蔺种子成熟后存在硬实率高和常温培养条件下发芽率低等繁殖局限，因此本试验选择幼胚作为外植体，且通过马蔺人工授粉后不同时间取幼胚，发现授粉后35～45 d 时，幼胚发育完成，而胚乳尚未完全硬化，此时，幼胚剥取容易，操作简单。

外源生长素和细胞分裂素是诱导细胞分化与增殖所必需的，2，4-D 是诱导胚性愈伤组织形成的重要激素［17］，鸢尾属植物中2，4-D配合细胞分裂素KT 或6-BA 对诱导胚性愈伤组织同样具有显著效果［18-21］。研究表明，高质量浓度2，4-D 诱导脱分化后必须及时降低或去掉2，4-D，胚性细胞才能正常发育，如不及时降低2，4-D 的质量浓度，球形胚就产生次生胚，当次生胚发育到球形胚后又循环继续形成次生胚，由此形成了分支的球形胚链，从而抑制了体胚的正常发育，而被“锁”在一个特殊的发育阶段［22］。本研究也得到相似的结果，通过不同质量浓度2，4-D 和6-BA 组合诱导马蔺幼胚形成愈伤组织的研究发现，1.0 mg·L-12，4-D和0.2 mg·L-16-BA 诱导马蔺幼胚形成胚性愈伤的效果较好，另外，将胚性愈伤进一步转接到较低质量浓度的2，4-D（0.25 mg·L-1）培养基上，可诱导出白色颗粒状体胚。与喜盐鸢尾（Iris halophila）成熟胚在含有2，4-D 1.0 mg·L-1和KIN 1.0 mg·L-1的培养基上连续培养后即可形成白色体胚的结果［21］不同。

TDZ 是一种人工合成的苯基脲衍生物，不仅具有很强的细胞分裂素活性，还具有生长素的效果，在组织培养中具有突出的作用［23］。如彭绿春等［24］研究表明6 种高山杜鹃（Rhododendronspp.）离体叶片在TDZ 诱导下分化率均可达到100%。王春夏等［25］发现TDZ 对朱顶红（Hippeastrum vitta-tum）不定芽的增殖有明显效果，且不同品种的效果不同，朱顶红‘花孔雀’相对‘黑天鹅’增殖的不定芽系数高且增殖的不定芽数量多。范春节等［26］发现不同浓度TDZ 诱导9 个尾细桉（Eucalyptus urophylla×E.tereticornis）无性系叶片获得再生植株。本试验结果表明，TDZ和NAA的组合效果要优于6-BA 和NAA 的组合，浓度为1.0 mg·L-1TDZ 和0.2 mg·L-1NAA 对不定芽的诱导率高达78.33%，增殖系数达3.65。

鸢尾属植物的生根相对容易，江明等［27］研究表明IBA、IAA、NAA、2，4-D 均可以诱导香根鸢尾（I.pallida）不定芽生根，生根率达95%以上；张芳和陈晨等［28-29］对德国鸢尾（I.germanica）不定芽生根的研究发现，NAA 质量浓度为0.5 mg·L-1时，鸢尾生根率最高可达100%。本研究发现马蔺的不定芽生根也较容易，在不含植物激素或添加少量NAA（＜0.2 mg·L-1）的MS 培养基即可生根，生根诱导率达到95%以上。生根后的组培苗移栽也是组培快繁的重要步骤，前人研究报道［28，30-31］，无论是否练苗，鸢尾组培苗均能较好地生长，但移栽时应注意控制基质湿度，湿度过大易引起组培苗根部腐烂［29］。本试验发现马蔺组培苗移栽至高压灭菌的蛭石中，成活率可达95%以上。